骨髓间充质干细胞源性的外泌体对早产儿脑损伤模型的免疫调节研究

发布时间：2020-04-25 23:08

【摘要】：【目的】:观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体对早产儿脑损伤模型中炎症因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)及转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的影响,探讨骨髓间充质干细胞旁分泌作用干预早产儿脑损伤的相关机制。【方法】:1.取大鼠的胫、股骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;荧光倒置显微镜下观察干细胞形态;超高速离心法富集骨髓间充质干细胞源性的外泌体;透射电镜确定提取外泌体的直径大小及蛋白电泳确定外泌体特定表达的蛋白分子。2.将新生3日龄清洁级SD大鼠的乳鼠随机分为四组:CONTROL组、WMD+PBS移植组、WMD+SUPERNATANT移植组和WMD+EXO组,制作早产儿脑损伤模型(white matter damage,WMD)。WMD+PBS移植组、WMD+SUPERNATANT移植组和WMD+EXO移植模型鼠经七氟烷吸入麻醉后予结扎左侧颈总动脉并吸入氧浓度为6%的氧氮混合气体2小时,制作早产儿脑白质损伤模型。对照组乳鼠麻醉后仅制作早产儿脑损伤模型,不做其他处理。WMD+PBS移植组造模后经左侧脑室定位注射5ulPBS液,WMD+SUPERNATANT移植组造模后经左侧脑室定位注射5ul SUPERNATANT,WMD+EXO移植组造模后经左侧脑室定位注射5ulEXO,对照组不予颅内注射。3.模型制作成功后,除CONTROL组,其余实验组分别侧脑室立体定向移植PBS,SUPERNATANT,EXO;采用苏木精-伊红(HE)染色法观察第7天脑组织病理改变;免疫组织化学法检测第7天时各组大鼠脑中IL-6,TGF-β阳性细胞数;在分别干预1天、2天、3天、5天、7天后,分别采用酶联免疫吸附和RT-PCR,检测脑组织匀浆中各组IL-6及TGF-β的分泌含量及mRNA表达水平。4.统计学分析:采用SPSS 16.0统计软件进行实验数据统计分析。正态分布计量资料以均数±标准差((x|-)±s)表示,对于本次研究中的重复测量数据采用重复测量的方差分析进行比较分析,组间两两比较采用BONFERRONI检验。两样本均数比较用t检验。P0.05有统计学差异,P0.01时具有显著统计学差异。【结果】:1.全骨髓贴壁法成功培养并提纯第三代骨髓间充干细胞,第三代细胞呈旋涡状生长,超高速离心法富集BMSCs-exo,通过透射电镜鉴定外泌体形态直径为60-80nm,Western-blot检测外泌体表面标志蛋白CDL-1及CD63。2.干预7天后,HE染色结果显示对照组及WMD+PBS移植组的乳鼠脑白质区见部分细胞变性、侧脑室扩张,海马区结构变异明显;WMD+SUPERNATANT移植组及WMD+EXO移植组的乳鼠脑白质区见轻微细胞水肿、变性,但较其余两组侧脑室扩张程度小,海马区结构变异轻,以WMD+EXO移植组变异程度最轻。3.免疫组织化学检测结果显示:CONTROL组及WMD+PBS移植组的乳鼠脑内IL-6阳性细胞数明显多于WMD+SUPERNATANT移植组及WMD+EXO移植组移植组,(BONFERRONI检验,P值均0.05);CONTROL组及WMD+PBS移植组的乳鼠脑内TGF-β阳性细胞数明显少于WMD+SUPERNATANT移植组及WMD+EXO移植组移植组,(BONFERRONI检验,P值均0.05)。4.ELISA显示干预1天、2天、3天、5天和7天后,CONTROL和WMD+PBS移植组的乳鼠脑内IL-6蛋白水平均在实验第5天达到峰值,随后呈下降趋势,至第7天时仍未降至正常水平;WMD+SUPERNATANT移植组及WMD+EXO移植组的乳鼠在各时间点IL-6蛋白表达水平显著低于CONTROL和WMD+PBS移植组,且第5天时间点中WMD+SUPERNATANT移植组及WMD+EXO移植组IL-6蛋白表达水平最低,差异具有统计学意义(BONFERRONI检验,P值均0.05)。ELISA显示干预1天、2天、3天、5天和7天后,CONTROL和WMD+PBS移植组的乳鼠脑内TGF-β蛋白水平均在实验第5天降至最低,随后稍呈增长趋势,至第7天时仍未升至正常水平;WMD+SUPERNATANT移植组及WMD+EXO移植组的乳鼠第5天时间点后TGF-β蛋白表达水平显著高于CONTROL和WMD+PBS移植组,后呈明显上升趋势,且各时间点中WMD+SUPERNATANT移植组及WMD+EXO移植组TGF-β蛋白表达水平与CONTROL组对比,差异具有统计学意义(BONFERRONI检验,P值均0.05)。【结论】:本实验成功收集培养细胞上清液及富集骨髓间充质干细胞源性外泌体,并通过透射电镜鉴定鼠骨髓间充质干细胞源性外泌体形态为类圆形,直径均值为60-80nm,Weatern-blot鉴定外泌体特异表达表面标志分子CAL-1及CD63;3日龄乳鼠予缺血缺氧处理造成的鼠模型符合早产儿脑白质损伤病理学改变。SUPERNATANT及BMSCs-EXO移植可以有效改善乳鼠大脑中受损细胞的形态及海马区变异程度,其中以EXO移植组效果最为显著,其改善缺氧缺血导致的脑损伤,调节脑内免疫炎症机制,可能与骨髓间充质干细胞以旁分泌作用,胞吐形式分泌的外泌体携带调控神经炎症的相关RNA,下调促炎症因子IL-6及上调抑炎症因子TGF-β的表达有关;证实BMSCs-exosome具有神经免疫调节、减轻早期炎症反应有关的作用。
【图文】：

1.4 分离实验时间点乳鼠脑制取鼠脑标本，乳鼠于吸入性七氟烷麻醉后，鼠俯卧位，于颈后部“十”字乳鼠皮肤后，手术剪离断全部鼠颈，矢状面分开鼠脑壳，于冠状沟处分开脑镊子小心拨开外层脑壳暴露实质脑，提取冠状沟前部全部脑，留取作后续实见图 1-D）。对于需留取灌注后的鼠脑标本实验，乳鼠于吸入性七氟烷麻醉后，鼠仰卧位动物试验台上，膈肌处分离表层皮肤及各层结缔组织，手术剪离断胸骨，分右两侧肋骨粘连皮肤，充分暴露心脏，保证在心脏跳动情况下，心尖处及对开一针孔大小，依次灌入 2 次 5ml 生理盐水-2 次多聚甲醛后，鼠俯卧位，后部“十”字切开乳鼠皮肤后，手术剪离断全部鼠颈，矢状面分开鼠脑壳，状沟处分开脑壳，镊子小心拨开外层脑壳暴露实质脑，，可见全白透明鼠脑，冠状沟前部全部脑，留取标本作后续实验。

表 1 不同时间点各组体质量表（x±s，g）Groups Beforetransplantation1dayaftersurgery2dayaftersurgery3dayaftersurgery5dayaftersurgery7asCONTROL 8.0 ±0.628.1 ±0.838.2 ±0.858.4 ±0.839.1 ±0.7990WMD+PBS 7.9 ±0.858.0 ±0.758.1 ±0.858.7 ±0.789.5 ±0.6810WMD+SUPERNATANT8.1 ±0.788.1 ±0.838.3 ±0.889.6 ±0.9810.8 ±0.9410WMD+EXO 8.2 ±0.598.1 ±0.888.4 ±0.939.8 ±0.94ab12.3 ±0.88ab10F 1.33 1.40 1.58 20.17 30.44 4P 0.87 0.79 0.65 0.038 0.041 0注 ： 与 对 照 组 相 比 ，aP<0.05 ； 与 WMD+PBS 组 相 比 ，bP<
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R722.6

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本文编号：2640795