Pappa2基因通过IGF信号通路影响小鼠髋关节发育

发布时间：2020-04-30 19:19

【摘要】：目的:发育性髋关节发育不良(developmental dysplasia of the hip,DDH)是造成儿童残疾和早期骨关节炎的主要原因之一。在我国,每1000个孩子中约有1.1~3.8名DDH患儿,危险因素包括臀位产,初产,羊水过少,高出生体重,直腿襁褓,女性及家族史等。DDH作为一种复杂的多基因病,具体病因不明,是遗传和环境因素共同作用的结果,其中遗传因素起着重要作用。前期,我们通过DDH家系的SNP芯片全基因组扫描分析研究,证实妊娠相关血浆蛋白-A2(pregnancy-associated plasma protein-A2,PAPP-A2)基因与DDH的发生相关。PAPPA2基因位于1号染色体的q24区域,包括23个外显子和22个内含子。而PAPP-A2蛋白作为一种金属蛋白酶,能够特异性的水解胰岛素样生长因子结合蛋白-5(insulin-like growth factor-binding protein-5,IGFBP-5)。它是胰岛素样生长因子结合蛋白家族成员之一,是6个家族成员中在骨骼中含量最丰富的一个。IGFBP-5能够和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)结合,形成IGF-I-IGFBP-5复合体,导致组织内游离的IGF1减少,从而降低IGF1的生物利用度。IGF作为与生长发育相关的重要因子,调节着软骨的发育及成纤维细胞合成胶原成份。而髋臼软骨发育不良和髋关节周围软组织松弛又是DDH发生的两大主要病理因素。因此,本研究旨在通过体外细胞及动物体内实验探明Pappa2基因如何通过IGF信号通路影响软骨组织及纤维组织的发育,进而导致DDH易感。我们首先进行体外细胞实验,通过上调或下调PAPP-A2蛋白的含量,来观察小鼠成纤维细胞系及原代软骨细胞中IGF1及胶原合成,软骨增殖的变化。同时也进行了动物体内实验,通过局部转染及羊膜腔注射转染PAPP-A2 sgRNA慢病毒来干扰Pappa2基因的表达,从而比较两组间小鼠髋关节发育和IGF信号通路相关蛋白表达的差异。方法:本研究分为两个部分。1、PAPP-A2异常表达对小鼠成纤维细胞系胶原合成及小鼠原代软骨细胞增殖的影响成纤维细胞系在培养皿中培养至细胞汇合后分别以(1)IGFBP-5蛋白,(2)PAPP-A2蛋白,(3)空白对照,(4)PAPP-A2 sgRNA慢病毒,(5)对照组慢病毒进行干预。按浓度梯度进行PAPP-A2蛋白、IGFBP-5蛋白干扰,同时进行慢病毒转染预实验,采用羟脯氨酸碱水解法测定各组成纤维细胞的胶原合成情况。确定最佳浓度后通过Western blot,Real time RT-PCR检测Ⅰ型胶原COL1A1及IGF1蛋白、mRNA的表达情况。原代软骨细胞在培养皿中培养至细胞汇合后分别以(1)IGFBP-5蛋白,(2)PAPP-A2蛋白,(3)空白对照,(4)PAPP-A2 sgRNA慢病毒,(5)对照组慢病毒进行干预。通过Western blot,Real time RT-PCR检测软骨细胞ACAN、Ⅱ型胶原COL2及IGF1蛋白,mRNA的表达情况。2、Pappa2基因低表达对小鼠髋臼、股骨头软骨增殖,髋臼周围软组织胶原合成及对小鼠髋关节形态的的影响PAPP-A2 sgRNA慢病毒及对照组慢病毒通过体表大转子定位,经胰岛素针分别注射到生后四天的雌性ICR小鼠(B4)右侧及左侧髋关节周围,在小鼠生后14天时(B14)处死取材,经过体式荧光显微镜观察荧光后,制作石蜡切片,提取RNA、蛋白观察IGF,COL1A1、COL2、ACAN、IGFBP-5、PAPP-A2的表达情况。PAPP-A2 sgRNA慢病毒经羊膜腔显微注射到孕13天(P13)小鼠子宫内。在胎鼠出生前一天(P19)处死孕鼠,获取慢病毒干扰的胎鼠。通过免疫荧光检测IGF、COL1A1、COL2、ACAN、PAPP-A2的表达情况。PAPP-A2 sgRNA慢病毒及对照组慢病毒通过体表大转子定位,经胰岛素针分别注射到生后4天的雌性ICR小鼠(B4)双侧髋关节周围,在小鼠生后14天时(B14)处死取材,观察大体组织形态变化,测量髋臼横径,经过体式荧光显微镜观察荧光后,制作石蜡切片,番红固绿染色观察软骨各层细胞(静止细胞层、增殖细胞层及肥大细胞层)及骨化情况。结果:1、在成纤维细胞中,随着添加的PAPP-A2蛋白浓度的增加,经平台期后,成纤维细胞胶原蛋白的表达上调。而添加IGFBP-5蛋白,成纤维细胞胶原蛋白的表达量较对照组降低。2、添加PAPP-A2蛋白干扰的成纤维细胞羟脯氨酸含量增加,IGF1表达上调;添加IGFBP5蛋白干扰的成纤维细胞IGF1,COL1A1表达下调。3、PAPP-A2 sgRNA慢病毒转染的成纤维细胞较对照组羟脯氨酸含量降低,IGF1、PAPP-A2表达下调,IGFBP5表达上调。4、添加PAPP-A2蛋白干扰的原代软骨细胞ACAN表达上调,而添加IGFBP5蛋白干扰的原代软骨细胞ACAN、COL2表达下调。5、PAPP-A2 sgRNA慢病毒转染的原代软骨细胞与对照组相比PAPP-A2、ACAN、IGF1表达下调,IGFBP5表达上调。6、通过髋关节局部注射PAPP-A2 sgRNA慢病毒的小鼠,在B14天时髋臼及股骨头软骨PAPP-A2、ACAN、COL2表达下调,IGFBP5表达上调。髋臼周围软组织IGF1表达下调。7、PAPP-A2 sgRNA慢病毒羊膜腔显微注射的小鼠,在P19天时小鼠髋臼股骨头软骨PAPP-A2、IGF1、ACAN、COL2表达下调,髋臼周围软组织PAPP-A2、IGF1、COL1A1表达下调。8、通过髋关节局部注射PAPP-A2 sgRNA慢病毒的小鼠,在B14天时髋臼横径增大,髋臼窝变浅,软骨细胞排列疏松,肥大细胞减少。结论:1、在成纤维细胞中,PAPP-A2蛋白干扰可上调成纤维细胞胶原的表达,并且呈现一定的剂量相关性。IGFBP-5蛋白干扰可下调成纤维细胞胶原的表达。2、Pappa2表达在成纤维细胞系及原代软骨细胞中与IGFBP-5表达负相关,IGFBP-5高表达可降低IGF1的表达。3、在小鼠髋臼周围软组织中Pappa2可通过影响IGFBP-5的表达间接影响IGF1的表达。4、在小鼠髋臼及股骨头软骨中,低表达的Pappa2可通过影响IGFBP-5的表达间接影响软骨的生长。5、Pappa2低表达可一定程度上影响小鼠髋臼形态。
【图文】：

相较于空白对照组，，明显增加成纤维细胞胶原蛋白的表达。而培养细胞用IGFBP-5 蛋白处理后，胶原蛋白的表达量较空白对照降低，但未发现与加入IGFBP-5 蛋白的浓度呈相关性。当 PAPP-A2 蛋白加入量 8 微克（表 4，图 1），IGFBP-5 蛋白加入量为 5 微克（表 5，图 2）时，羟脯氨酸含量变化有意义。表 4 PAPP-A2 处理对成纤维细胞胶原表达的影响PAPP-A2(μg) EXP(μg/ml) CONT(μg/ml) EXP/CONT0.352 0.8886 1.4486 0.60.88 2.1510 2.0999 1.02431.32 2.2221 2.1862 1.01641.76 2.1208 2.1862 0.97014.4 2.2611 2.6058 0.86776.6 0.2479 0.1700 1.45878.8 0.326474 0.237523 1.374494注：所用 PAPP-A2 浓度为 0.44μg/μl。EXP：为不同容量 PAPP-A2 处理后的胶原蛋白实际表达量；CONT：为相应 PAPP-A2 处理组对照样本的胶原蛋白实际表达量。

中国医科大学博士学位论文表 5 IGFBP-5 处理对成纤维细胞胶原表达的影响IGFBP-5(μg) EXP(μg/ml) CONT(μg/ml) EXP/CONT2.0 1.0260470.9982711.0278242.5 1.65832.09990.78975 1.84432.09990.87838 2.1159 2.3581 0.897310 2.0824 2.6058 0.7991注：所用 IGFBP-5 浓度为 1μg/μl。EXP：为不同容量 IGFBP-5 处理后的胶原蛋白实际表达量；CONT：为相应 IGFBP-5 处理组对照样本的胶原蛋白实际表达量。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R726.8

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本文编号：2646098