呼吸道合胞病毒F蛋白编码基因重组腺病毒载体的构建及表达

发布时间：2020-05-01 12:07

【摘要】：人类呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是引起世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒病原之一，同时也是免疫抑制或缺陷的成人和老年人呼吸道感染的重要病原。鉴于RSV感染危害严重且无特异有效的治疗方法和疫苗，1994年WHO已将RSV疫苗的研制列为全球疫苗计划的优先发展项目之一。 RSV融合蛋白(Fusion protein，F蛋白)是RSV病毒主要的保护性抗原，并且在RSV A、B两型间相对保守，可以诱生抗野生型RSV感染的中和抗体。其中190～289位氨基酸含有2个重要的抗原表位区，能够被大部分F蛋白特异性单克隆抗体所识别，并且这段氨基酸序列形成的构象也满足了中和表位的要求，这些都为真核表达提供了合理依据。 腺病毒载体是可经粘膜免疫的理想载体，，目前已广泛应用于人类疾病的基因治疗，重组疫苗及外源基因在哺乳动物细胞中的表达。本研究首先在Vero细胞上培养RSV(A2株)病毒，从病变细胞中提取了病毒RNA。根据Gene Bank中RSV核苷酸序列设计引物，并在上游引物的5’端分别加入Kpn Ⅰ酶切位点和Kozak片段；下游引物的5’端添加Hind Ⅲ酶切位点和终止密码子TAG。采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-Polymerase chain reaction，RT-PCR)技术特异性扩增出F基因片段(559～867位碱基)，TA克隆后经双酶切、PCR等方法筛选重组质粒，序列分析证实插入序列编码框正确后，再经双酶切、连接等分子生物学手段构建含有目的基因的重组穿梭质粒pShuttle-CMV／F。通过电转化法将经PmeⅠ酶切线性化的pShuttle-CMV／F和对照质粒pShuttle-CMV-lacZ转入含有pAdEasy-1骨架质粒的BJ5183-AD-1感受态细菌，经鉴定同源重组成功的克隆，命名为重组腺病毒质粒pAdEasy／F和pAdEasy／lacZ。接着，将二者分别转化XL-10 Gold超感受态细菌获得高拷贝重组腺病毒质粒。大量提取重组腺病毒质粒，经Pac Ⅰ酶切回收后定量。运用磷酸钙法转染293细胞，48～72小时内将对照组X-Gal原位染色检测转染效率。实验组于37℃继续培养，7～10天后出现细胞病变(CPE)，成功获得了非复制型重组腺病毒rAd／F。收集病变细胞，在透射电镜下观察重组病毒具有典型的二十面体形态，直径约70nm。PCR结果表明
【图文】：

PAdEasy·1VeetorMaPp8R322onIe升armhomoIOgvlr护ae1.omP一c.ll一nzC盆a1.nghtorrnhomo!叩丫PAdEasy·133.5kbAds(El/E3一delotod)

图1一4穿梭载体和骨架载体同源重组示意图1一4HomologoL一5reeombinationbetweentheshuttleveetorandPAdEasy一1ve
【学位授予单位】：北京生物制品研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R373;R725.6

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 许超凡;王华;;毛细支气管炎临床特征及诊治要点[J];临床误诊误治;2010年S2期

2 陈翊;朱冰;连广琬;张莹莹;谢嘉慧;刘晓敏;;2009—2010年广州地区儿童呼吸道合胞病毒感染分析[J];广东医学;2011年10期

3 赵乔佳杰;侯敢;黄迪南;陈书勇;;基质金属蛋白酶介导的人肿瘤坏死因子α融合蛋白的构建和表达[J];生物医学工程学杂志;2011年03期

4 阙一平;;四季抗病毒合剂佐治毛细支气管炎疗效观察[J];医学信息(中旬刊);2011年06期

5 莫云芝;张建菲;李慧芳;;更昔洛韦治疗小儿呼吸道合胞病毒肺炎的临床研究[J];中国现代药物应用;2011年12期

6 常婷;林宏;刘煜;李柱一;;人AChR-Fc融合蛋白真核表达载体的构建和表达[J];中国神经免疫学和神经病学杂志;2011年04期

7 王桂玲;王孝会;都田赵;陈薇;姜佩家;;原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达[J];解剖科学进展;2011年04期

8 郗永义;胥照平;高丽华;邵勇;胡显文;陈惠鹏;;炭疽受体CMG2-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达、纯化与鉴定[J];现代生物医学进展;2011年11期

9 袁丰瑞;张敏静;仝雷;苏志坚;项琪;黄亚东;;抗Her-2抗体与人β防御素Ⅱ融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定[J];中国药科大学学报;2011年03期

10 商阿丽;唐亮;曹传平;武雪宾;郑玲莉;何俊民;鞠佃文;;rhEPO-Fc融合蛋白质量标准的研究[J];科技资讯;2011年19期

相关会议论文 前10条

1 王玉梅;刘畅;蒙冲;郭风云;;HEV ORF_2重组菌菌种的稳定性及融合蛋白的应用[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展（上册）[C];2001年

2 陈金顶;廖明;辛朝安;;鹅Ⅰ型禽副粘病毒株融合蛋白(F)基因的克隆及序列分析[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

3 杨素荣;姚明辉;;细胞因子GM-CSF、IL-3和GM-CSF/IL-3融合蛋白对辐射致Tf-1细胞凋亡的影响[A];中国药理学会第八次全国代表大会暨全国药理学术会议论文摘要汇编[C];2002年

4 龚朝辉;金勇丰;张耀洲;;CTB和胰岛素融合蛋白在家蚕中表达的研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年

5 李芳芳;;重症肌无力单链抗体融合蛋白的酵母菌表达及特异性鉴定[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年

6 杨燕凌;;酶(蛋白)融合技术研究[A];华东地区农学会学术年会暨福建省科协第七届学术年会农业分会场论文集[C];2007年

7 毛华;陈松森;狄旭;贾佩臣;梁植权;;重组人SCF-GM-CSF融合蛋白的克隆、表达及生物学活性研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

8 陈丽华;王强;侯万国;;不同链接剂修饰的融合谷胱甘肽活性的研究[A];中国化学会第十二届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2009年

9 陈任安;刘利;梁英民;;抗PTD-bcr/abl单克隆抗体的制备及鉴定[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

10 蔡斌;林毅;薛偕华;方玲;吴志英;王柠;;TAT-Ngb融合蛋白的原核表达及其对小鼠脑缺血影响的研究[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年

相关重要报纸文章 前10条

1 邵建国;帕利珠单抗打响保卫战[N];医药经济报;2010年

2 记者 朱敏丽　通讯员 潘越;中国医药城首批融合蛋白试剂出口[N];泰州日报;2010年

3 金陵;融合蛋白试剂首次出口美国[N];中国医药报;2010年

4 吴红梅;我省首批融合蛋白试剂出口美国[N];新华日报;2010年

5 张见麟;小心呼吸道合胞病毒随冷空气而至[N];健康报;2003年

6 记者 张晔　通讯员 刘宁春;一种有效治疗冠心病的融合蛋白发现[N];科技日报;2009年

7 通讯员 沈季 记者 张兆军;抗肿瘤融合蛋白进入临床试验[N];科技日报;2005年

8 记者 李晓;4年追踪揪出儿童感冒“元凶”[N];苏州日报;2010年

9 记者 魏巍 通讯员 沈季;吉大一抗肿瘤新药进入临床试验阶段[N];长春日报;2005年

10 冯卫东;抑制蛋白相互作用可成为治癌新方法[N];科技日报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 柏亚铎;犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究[D];中国农业大学;2005年

2 张怀;人Hepcidin融合表达载体的构建、在大肠杆菌中的表达及制备研究[D];北京化工大学;2005年

3 王玉梅;嵌合降钙素基因的构建及表达[D];中国海洋大学;2005年

4 徐海燕;人BAFF基因转染细胞及其单克隆抗体的生物学特性[D];苏州大学;2005年

5 石炳兴;靶向溶栓抗凝双功能融合蛋白的构建表达及在血栓疾病治疗中的应用研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年

6 蒋骅;GST-EGFR融合蛋白冲击树突状细胞治疗头颈部鳞状细胞癌体内外实验观察[D];浙江大学;2008年

7 徐越驰;组氨酸为活性中心的蛋白质酪氨酸磷酸酶和细胞自噬标记物的研究[D];吉林大学;2010年

8 刘荣;人4-1BBL/抗CD20融合蛋白增强抗CD3/抗CD20双功能抗体的细胞毒作用及其机制研究[D];中国协和医科大学;2010年

9 钟根深;以明胶酶为靶点的小型化抗体与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性的研究[D];中国协和医科大学;2010年

10 张海涛;重组人干扰素-α2b与内皮抑素肽融合蛋白抗肿瘤研究[D];哈尔滨师范大学;2012年

相关硕士学位论文 前10条

1 陈U

本文编号：2646628