PAK4在TGF-β1诱导人肾小管细胞上皮—间质转分化中的机制研究

发布时间：2020-05-02 19:33

【摘要】：目的:慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是一个不可逆的疾病进展过程,最终发展为肾衰竭,进入终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)。CKD在儿童肾脏疾病中占大约1.2%,在肾脏疾病致死的患儿中,CKD致死率为9%。儿童一旦进入ESRD,会对其生长发育、心理健康等产生很大影响,生存质量降低,且ESRD死亡率极高。肾小管细胞的上皮-间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在CKD肾纤维化的发生发展中起到了极为重要的作用。在众多EMT的调节机制中,转化生长因子beta(Transforming growth factor beta,TGF-β)信号途径被认为是最主要的调节机制,而作为最主要的促纤维化因子,TGF-β在肾小管上皮细胞以及肾小球足细胞的EMT中扮演了非常重要的角色。P21活化蛋白激酶(p21-activated kinase,PAK)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,进化保守,是Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42和Rac下游重要的靶蛋白。生长因子以及其细胞外信号能够通过GTP酶和非GTP酶依赖的信号通路致PAKs活化,从而使PAKs参与细胞骨架、细胞生存、细胞有丝分裂和血管生成等生物学功能。目前研究发现,PAKs家族共有6个成员,根据它们的结构特点以及相似性,分为两大类,I类包括PAK1、PAK2和PAK3,II类包括PAK4、PAK5和PAK6。PAK4是II类PAKs中最早被报道的成员,大多数组织中都有表达,在前列腺、睾丸和结肠中表达水平较高。有研究显示PAK4与肿瘤的EMT相关。本研究应用TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞发生EMT时,探讨PAK4在肾小管细胞上皮-间质转分化中表达的变化以及PAK4在TGF-β1诱导的肾小管细胞上皮-间质转分化中的作用及其机制方法:常规培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),设定浓度梯度:分别给予0、l、2、5及10 ng/ml的TGF-β1刺激HK-2细胞48小时;设定时间梯度:均给予5ng/ml的TGF-β1刺激HK-2细胞0、12、24、48及72小时,在相差显微镜下观察不同浓度及时间刺激对细胞形态的影响;应用Western blot、RT-PCR及免疫荧光方法检测各组细胞的PAK4、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、纤粘连蛋白(Fibronectin)及波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达水平及mRNA表达水平;应用Transwell小室法检测不同浓度及时间刺激对HK-2细胞迁移能力的影响。根据基因序列设计特异引物,扩增PAK4基因片段,用慢病毒转染法将Flag-PAK4转染至HK-2细胞,构建过表达PAK4的稳转细胞系。慢病毒转染5天后,应用Western blot检测过表达PAK4的稳转细胞系是否构建成功。在过表达PAK4的稳转细胞系中,应用Western blot及RT-PCR检测E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达,Transwell小室法检测过表达PAK4后HK-2细胞迁移能力的变化。另外给予5ng/ml的TGF-β1刺激过表达PAK4稳转细胞系48h,应用相差显微镜观察过表达PAK4的细胞形态变化,应用Western blot及RT-PCR检测经TGF-β1诱导各组的E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达,Transwell小室法检测相应细胞迁移能力的变化。另外,设计了人PAK4靶向性shRNA,用慢病毒转染法将shPAK4转染至HK-2细胞,构建沉默PAK4的稳转细胞系。慢病毒转染5天后,应用Western blot检测过表达PAK4的稳转细胞系是否构建成功。在沉默PAK4的稳转细胞系中,应用Western blot、免疫荧光及RT-PCR检测E-cadherin、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达,Transwell小室法检测沉默PAK4对细胞迁移能力的变化。另外给予5ng/ml的TGF-β1诱导48h,应用Western blot、免疫荧光及RT-PCR检测经TGF-β1诱导各组的E-cadherin,、Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达,Transwell小室法检测细胞迁移能力的变化。应用Western blot方法检测沉默PAK4后,细胞中β-catenin的变化,应用免疫荧光法检测过表达PAK4稳转细胞系中β-catenin定位的变化结果:1.TGF-β1刺激HK-2细胞后,细胞呈梭形变,变细、变长,细胞间距增加,同一视野下细胞数量减少。2.TGF-β1以时间依赖和剂量依赖的方式下调HK-2细胞E-cadherin蛋白及mRNA表达,上调Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达,且最佳作用时间为48小时,最佳作用浓度是5 ng/ml。3.TGF-β1诱导HK-2细胞产生EMT时,PAK4表达增加,且随着TGF-β1刺激时间的延长以及剂量的增加,PAK4蛋白表达增加,但mRNA表达水平无变化。4.随着TGF-β1浓度增加,HK-2细胞的迁移能力增强。5.在HK-2细胞中通过慢病毒转染法构建过表达PAK4及沉默PAK4的稳转细胞系成功。6.过表达PAK4后,细胞呈梭形变,变细、变长,细胞间距增加,同一视野下细胞数量减少。7.过表达PAK4后,E-cadherin蛋白及mRNA表达水平下降,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达水平增加。8.过表达PAK4后,HK-2细胞的迁移能力明显增强,并且能够与TGF-β1发挥协同作用,使HK-2细胞迁移能力进一步增强。9.过表达PAK4使TGF-β1诱导的E-cadherin的蛋白及mRNA表达水平进一步减少,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达水平进一步增加。10.沉默PAK4后,E-cadherin蛋白及mRNA表达水平上升,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达水平下降。11.沉默PAK4后,HK-2细胞的迁移能力减弱,并且能够进一步减弱TGF-β1诱导的HK-2细胞的迁移。12.沉默PAK4使TGF-β1诱导的E-cadherin蛋白水平无明显增高,但mRNA表达水平增加,Fibronectin及Vimentin的蛋白及mRNA表达水平减少。13.沉默PAK4使TGF-β1诱导的β-catenin蛋白表达减弱。14.免疫荧光可见过表达PAK4后,β-catenin蛋白定位发生变化,由细胞膜转移到细胞核。结论:1.TGF-β1能诱导HK-2细胞产生EMT,与E-cadherin、Fibronectin及Vimentin存在剂量依赖性及时间依赖性,且随着TGF-β1刺激浓度增加,HK-2细胞的迁移能力增强。2.TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT,PAK4也参与了该过程,且其蛋白表达水平与TGF-β1存在剂量依赖性和时间依赖性,但其mRNA水平无变化。3.PAK4能够独立诱导HK-2细胞发生EMT。4.过表达PAK4与TGF-β1协同诱导HK-2细胞发生EMT。5.沉默PAK4能够抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞发生EMT。6.PAK4促进TGF-β1诱导的HK-2细胞发生EMT是通过激活β-catenin通路实现的
【图文】：

TGF-β1 对 HK-2 细胞形态的影响TGF-β1 (5ng/ml)刺激 HK-2 细胞 72h 后，倒置显微镜观察刺激前后的细胞形态变化(10X)。3.1.2 TGF-β1 对肾小管上皮细胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin 蛋白及mRNA 表达的影响3.1.2.1 不同浓度 TGF-β1 对 HK-2 细胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin蛋白及 mRNA 表达的影响Western blot 结果显示，随着 TGF-β1 刺激浓度增加，，HK-2 细胞 E-cadherin蛋白表达水平明显下调，而 Fibronectin 及 Vimentin 蛋白表达水平逐渐上调, 与TGF-β1 呈剂量依赖性，见图 2A。

TGF-β1 对 HK-2 细胞形态的影响TGF-β1 (5ng/ml)刺激 HK-2 细胞 72h 后，倒置显微镜观察刺激前后的细化(10X)。2 TGF-β1 对肾小管上皮细胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vimentin 蛋NA 表达的影响3.1.2.1 不同浓度 TGF-β1 对 HK-2 细胞 E-cadherin、Fibronectin 及 Vim及 mRNA 表达的影响Western blot 结果显示，随着 TGF-β1 刺激浓度增加，HK-2 细胞 E-cad表达水平明显下调，而 Fibronectin 及 Vimentin 蛋白表达水平逐渐上调-β1 呈剂量依赖性，见图 2A。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R726.9

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 闫U

本文编号：2647419