抗增殖蛋白参与肾间质纤维化的分子机制研究

发布时间：2020-05-05 16:32

【摘要】： 临床上多种肾脏疾病不论其最初的发病因素如何，若慢性进展，则肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是它们的共同通路，最终会发展为终末期肾脏疾病(end stage renal disease，ESRD)。目前已经明确转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一种最重要的促肾脏纤维化因子，既可以活化肾间质成纤维细胞，也可以使肾小管上皮细胞发生表型改变，使它们转变为具有肌细胞表型的肌成纤维细胞，进而导致细胞周期失衡而无限制增生，并表达大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，这是肾小管间质损伤发生、发展至RIF的重要机制之一，因此寻找RIF过程中的负调控因子，进行早期干预，减轻或阻止肾小管间质损伤从而减缓肾脏病慢性进展已经成为肾脏病领域研究的热门话题。研究表明多种RIF过程中的负调控因子如肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor，HGF)等可以通过抑制TGF-β1而发挥抗纤维化作用。黄文彦等以单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)方法建立RIF大鼠模型，检测肾组织的基因表达谱时发现抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)基因明显下调并推测其为介导RIF的重要基因之一。已知PHB基因是一种近年来发现的肿瘤抑制基因，它所编码的PHB蛋白结构保守，在细胞代谢、生长、衰老以及凋亡等诸多方面发挥着重要的调控作用。但关于PHB在正常以及病变肾组织中的表达规律，以及关于PHB是否可以影响TGF-β1所诱导的肾脏成纤维细胞生物学行为变化及其分子机制，国内外均未见报道。为此我们进行了以下三部分的研究，以初步探讨PHB在肾小管间质损伤的作用地位。第一部分抗增殖蛋白在儿童肾小管间质中的表达及意义目的：观察不同程度肾小管间质损伤的患儿肾活检组织中抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)的表达以及分布规律，探讨PHB表达与肾小管间质损伤之间的关系。对象与方法：选取不同病因和类型的原发性肾小球肾炎患儿肾活检标本48例，其中病理类型为微小病变(MCNS)9例，系膜增生性肾炎(MsPGN)12例，局灶节段性肾小球硬化(FSGS)5例，膜性肾病(MN)4例，IgA肾病(IgAN)18例，并以9例正常的肾组织标本作为对照。根据常规染色光镜下肾小管间质的病变分组，分级结果为：0级22例，1级13例，2级12例，3级10例。以免疫组织化学方法分别检测各组标本PHB和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达，并将PHB阳性表达指数与α-SMA阳性表达指数、肾小管间质损伤程度、患儿肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)及尿乙酰-β-D葡萄糖苷酶(urinary N-acetyl-β-D-glucosamccharase，NAG)水平进行比较。结果：正常肾组织中PHB蛋白质阳性表达，程度由髓质向皮质逐步减弱，主要表达于肾小管上皮细胞及部分间质细胞，而血管阴性；在肾小球系膜细胞弱阳性，肾小球上皮细胞、内皮细胞未见表达。随着肾小管间质损伤程度的加重，上述细胞PHB的表达逐渐减弱，表达范围也发生了一定的变化，损伤严重的肾小管上皮细胞和增生明显的间质细胞几乎不表达PHB，肾小球系膜细胞亦阴性。不同分级肾小管间质PHB蛋白质阳性表达指数两两比较有显著性差异(F=82.6，P＜0.01)。α-SMA蛋白在损伤肾间质区域表达增强，在管腔破坏和萎缩的肾小管上皮细胞明显表达。不同分级肾小管间质α-SMA蛋白质阳性表达指数两两比较有显著性差异(F=90.5，P＜0.01)。根据线性回归分析，肾小管间质中PHB、α-SMA表达量之间负相关(r=-0.756，P＜0.01)，在损伤的肾小管间质中，PHB与忠儿尿NAG水平之间显著负相关(r=-0.802，P=0.003)，与患儿GFR水平无相关性(r=-0.447，P=0.232)。Spearman等级相关分析显示，肾小管间质损伤程度与PHB表达量显著负相关(r=-0.802，P=0.003)，与α-SMA表达量显著正相关(r=0.765，P=0.006)。结论：人类正常肾组织存在着一定程度的PHB蛋白质表达，在损伤肾小管间质中PHB表达降低，PHB蛋白表达水平与肾小管间质损伤程度负相关，与尿NAG水平显著负相关，，提示PHB很可能是与肾小管间质损伤有关的一种新的重要指标。第二部分抗增殖蛋白抑制TGF-β1诱导的肾脏成纤维细胞增殖、表型改变和细胞外基质表达目的：观察抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)对肾间质成纤维细胞增殖、表型变化及表达细胞外基质等生物学行为的影响并探讨机制。对象与方法：(1)观察PHB在大鼠肾脏成纤维细胞(normal renal kidneyfibroblasts，NRK-49F)中亚细胞定位，以Western印迹和RT-PCR测定NRK-49F细胞受到TGF-β1作用后PHB表达的变化。(2)从NRK-49F细胞中扩增大鼠PHB基因全长的cDNA，构建真核表达质粒，测序成功后转染NRK-49F细胞；观察转染PHB质粒对NRK-49F细胞周期和细胞生长曲线的影响。(3)观察转染PHB质粒对NRK-49F细胞表达α-SMA、细胞外基质纤连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅲ型胶原(collagen typeⅢ，ColⅢ)以及基质金属蛋白酶-1(matrixmetalloproteinase-1，MMP-1)蛋白质和mRNA表达的影响。结果：(1)激光共聚焦显微镜下见PHB主要分布于NRK-49F的细胞质，细胞核亦有比较弱的表达。加入TGF-β1后NRK-49F细胞中PHB蛋白和mRNA表达均明显下调，并且呈现时间依赖关系和剂量依赖关系。(2)成功构建PHB真核表达质粒pcDNA3.1(-)／PHB，重组质粒经测序所得887bp的目的片段与Genebank中的原序列(BC097304)100％符合。Western印迹结果显示，对数生长期NRK-49F细胞有PHB蛋白基础表达，重组质粒转染后PHB表达升高约2.54倍(与空白对照组相比，P＜0.01)，而转入空载体的细胞PHB的表达与未转染的细胞比较无明显变化(P＞0.05)，提示转染成功。(3)TGF-β1可以明显刺激NRK-49F细胞增殖，使更多的细胞脱离G0／G1期而进入S期和G2／M期(与空白对照组相比，P＜0.01)，转染PHB质粒可以明显抑制TGF-β1诱导的增殖，使更多的细胞维持于G0／G1期(与TGF-β1组比较，P＜0.01)，而对未受到TGF-β1的细胞生长则无影响(与空白对照组相比，P＞0.05)。TGF-β1明显刺激NRK-49F细胞生长，转染PHB质粒可以明显抑制TGF-β1诱导的细胞增殖，24-48h之间抑制最明显，24h时增殖抑制率27％，48h时增殖抑制率达48％，72h时增殖抑制率仍有35％，而对未受到TGF-β1的NRK-49F细胞生长几乎无影响(与空白对照组相比，P＞0.05)。(4)空白组NRK-49F细胞不表达α-SMA蛋白和mRNA，TGF-β1刺激NRK-49F细胞表达α-SMA，并呈现时间和剂量依赖关系，转染PHB基因可明显抑制TGF-β1所诱导的α-SMA蛋白和mRNA表达(与TGF-β1组比较，P＜0.01)，而对细胞中α-SMA的基础表达无影响(与空白对照组相比，P＞0.05)。TGF-β1刺激NRK-49F细胞后FN、ColⅢ和MMP-1 mRNA表达上调，分别为对照组的1.80倍、2.04倍和1.77倍；预先转染PHB基因可以抑制TGF-β1诱导的FN和ColⅢmRNA表达上调，抑制率分别为44％和46％(与TGF-β1组比较，Ps＜0.01)，但对MMP-1mRNA表达无影响(与TGF-β1组比较，P＞0.05)。TGF-β1刺激NRK-49F细胞中FN、ColⅢ、MMP-1和E2F1蛋白表达上调，分别为对照组1.68倍、2.14倍、1.87倍和1.64倍；预先转染PHB基因可以抑制TGF-β1诱导的FN、ColⅢ和E2F1蛋白质表达上调，抑制率为30％、47％和44％(与TGF-β1组比较，P＜0.01)，但对MMP-1蛋白表达无影响(与TGF-β1组比较，P＞0.05)。结论：NRK-49F细胞中有内源性PHB表达，主要分布于细胞质，细胞核亦有较弱表达；TGF-β1可以使NRK-49F中PHB表达下调；外源性PHB显著抑制TGF-β1所诱导的成纤维细胞增殖、表型改变和表达细胞外基质，提示PHB可能成为防治RIF的新靶点。第三部分抗增殖蛋白通过抑制Smad3核转位而拮抗TGF-β1对肾脏成纤维细胞的诱导目的：探讨抗增殖蛋白(Prohibitin，PHB)拮抗TGF-β1对肾脏成纤维细胞的诱导的分子生物学机制。对象与方法：NRK-49F细胞生长至80％融合时转染或不转染pcDNA3.1(-)／PHB质粒，12h后换用无血清DMEM培养基，饥饿24h再加入或不加入1ng／ml TGF-β1，继续孵育30min或48h，收获细胞。以Western印迹方法检测细胞总蛋白中Smad7和磷酸化Smad3的表达，以免疫共沉淀检测细胞总蛋白中与Smad2／3结合的Smad4的量；分别抽提细胞浆与细胞核，以Western印迹方法检测细胞核中磷酸化Smad3的表达量。结果：(1)TGF-β1处理后NRK-49F细胞中磷酸化Smad3的表达量明显增多(与空白对照组相比，P＜0.01)，转染PHB质粒对TGF-β1诱导的Smad3磷酸化无影响(与TGF-β1组比较，P＞0.05)；TGF-β1处理以及转染PHB质粒对NRK-49F细胞中Smad7表达水平无影响(与空白对照组相比，Ps＞0.05)。(2)免疫共沉淀检测发现TGF-β1处理后细胞中与Smad2／3结合的Smad4表达量增多(与空白对照组相比，P＜0.01)，转染PHB质粒对TGF-β1诱导的Smad4和Smad2／3结合无影响(与TGF-β1组比较，P＞0.05)。(3)TGF-β1处理后NRK-49F细胞中核蛋白磷酸化Smad3的表达量明显增多(与空白对照组相比，P＜0.01)，转染PHB质粒可以降低核蛋白中磷酸化Smad3的表达量(与TGF-β1组比较，P＜0.01)。结论：PHB对TGF-β1诱导的Smad3磷酸化、Smad7表达量以及与Smad3结合的Smad4的量均无影响，但是能够抑制TGF-β1诱导的Smad3入核，提示PHB很可能是通过抑制活化的Smad3发生核转位而拮抗TGF-β1对肾脏成纤维细胞的诱导。总结 1、首次发现人肾组织表达PHB蛋白，主要分布于一些间充质来源细胞如肾小管上皮细胞和肾间质细胞，PHB蛋白表达水平与肾小管间质损伤程度反向相关； 2、NRK-49F细胞有内源性PHB表达，主要分布于细胞质中，细胞核里亦有较弱表达； 3、受TGF-β1作用后NRK-49F细胞中PHB蛋白和mRNA表达均下调，外源性PHB抑制TGF-β1诱导的NRK-49F增殖，使细胞周期停滞于G0／G1期，可以抑制TGF-β1诱导的NRK-49F表型变化并减少分泌细胞外基质表达，但不影响MMP1的表达； 4、PHB可以抑制活化的Smad3发生核转位，这很可能是PHB拮抗TGF-β1对肾脏成纤维细胞的诱导活化的关键所在，因此PHB有可能成为减缓肾脏疾病慢性进展的一种新的分子靶标。
【图文】：

信号转导通路

表达明显降低，分化时PHB表达明显升高，基因转染过量表达PHB可抑制人白血病细胞、前列腺癌细胞等进入细胞增殖周期，基因干扰PHB表达则可促进上述细胞增殖【35一371。图1显示目前所知道的有关PHB的信号通路，还存在许多问号等待我们去解答，还存在许多问题需要我们去验证。鉴于PHB具有明显的抗细胞增殖作用，同时基因芯片检测结果也发现纤维化大鼠肾组织PHB基因表达明显下调，提示这种下调很有可能参与了租F的发生发展，然而PHB在正常以及病变肾组织中的分布、表达规律以及是否与具有肾脏保护作用，尚未检索到国内外有相关报道。为了研究PHB基因及其表达产物在肾脏纤维化过程中的表达以及变化规律，探讨PHB在RIF发生发展中的意义

曲线,蛋白,蛋白表达,作用时间

图2:TGF一印使NRK一49F细胞中PHB蛋白和mRNA表达下调。A:以相同剂量(0.2nmol/L)的各种生长因子刺激细胞48h;B:PHB蛋白表达的剂量依赖曲线，作用时间为48h;c:PHB蛋白表达的时间依赖曲线，TGF一pl剂量为1ng八nl;D:PHBmRNA表达的剂量依赖曲线，作用时间为48h。*，与对照组比较，尸<0.01，实验重复3次。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R726.9

【引证文献】