儿童结核性脑膜炎脑脊液蛋白质组学的初步研究

发布时间：2020-05-07 04:54

【摘要】： 目的结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TM)是小儿时期一种严重的中枢神经系统感染性疾病。其病死率为20％～50％，幸存者中有20％～30％留有永久性神经系统后遗症。TM发病机制尚不完全清楚，诊断困难，预后较差。蛋白质组学技术是近年来出现的一种研究特定细胞、组织或完整生物体所表达的全部蛋白质及其活动规律的新兴学科。本实验通过该技术建立正常中国儿童及TM患儿脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)蛋白质双向凝胶电泳图谱，筛选TM特异性蛋白，为TM的早期诊断提供线索，同时也为其发病机制的深入了解提供新思路。 方法收集TM急性期、TM治疗1个月后及正常对照组儿童CSF各5ml，三氯乙酸(trichloracetic acid，TCA)沉淀法获取CSF总蛋白质，固相PH梯度(immobile PH gradient，IPG)二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE)技术分离蛋白质，考马斯亮蓝染色，Imagescanner扫描仪以及LabScan扫描软件对凝胶进行扫描获取图像。利用图像分析软件PDQuest 7.0，以正常儿童CSF的2-DE凝胶为参考胶，将TM急性期CSF的凝胶与之进行比较分析，寻找两组CSF蛋白质谱的异常变化斑点。再以TM急性期CSF凝胶为参考胶，将TM治疗1个月后CSF凝胶与之比较分析，观察差异蛋白质斑点的变化情况。筛选出分辨清楚、仅在TM急性期CSF中表达的蛋白质斑点，切取后进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption／ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析，获得肽质量指纹图谱(Peptide mass fingerprinting，PMF)，运用生物信息学技术获取蛋白的基本信息，确定差异蛋白质。 结果正常儿童CSF分离获得蛋白质斑点533个，TM急性期CSF分离获得蛋白质斑点546个，其中有14个蛋白质点仅在正常CSF表达，27个蛋白质点仅在TM急性期CSF中表达，在TM急性期高丰度表达的蛋白质点，在TM治疗1个月后CSF中表达量均下调与正常CSF蛋白质点表达量比较，TM急性期有15个蛋白质点表达量有2倍以上的上调，而8个蛋白质点表达量有2倍以上的下调。共选出20个差异蛋白质点进行MALDI-TOF-MS分析，获得了20张PMF。进入数据库进行搜索后匹配到蛋白质的点有16个，发现载脂蛋白A-I、免疫球蛋白J链、人多克隆免疫球蛋白M冷凝集素Fab片段、免疫球蛋白λ轻链VLJ区、MGC31936蛋白、免疫球蛋白λ轻链可变区、抗肿瘤坏死因子α抗体、免疫球蛋白G1 A链Fab片段、免疫球蛋白KC、HLA-Ⅱ类抗原DRB1-4、PRO2675蛋白、MRP14蛋白在TM急性期CSF中特异性表达。 结论本实验首次成功建立了正常儿童CSF与TM患儿CSF的双向凝胶电泳图谱。通过凝胶图像分析和计算机信息处理，发现了一些与TM相关的蛋白质差异位点。经质谱分析及生物信息学技术初步鉴定了部分差异蛋白质，发现载脂蛋白A-I、抗肿瘤坏死因子α抗体、HLA-Ⅱ类抗原DRB1-4、MRP14蛋白可能与TM的发生发展密切相关，这些蛋白能否成为TM诊断的标记物，值得进一步的研究。
【图文】：

质谱使用基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内对照进行标准校正。每个蛋白样品分别测定3次的质谱峰，采用 DataexPforer软件分析，显示的质谱峰界面如图2一2所示。10U如 VOyagerSPee口1旧P一2湘02，242061，决扣刀21朋祖60团匆延。解一畏19加871q2297刀ZB矍黔C37741501望豁也灵骂蠕润扫闷34D57猛犷.赫、图2一 2MALDI一TOF一MS肤质量指纹图谱(X轴为m/z;Y轴为相对强度)2.2.6.3生物信息学通过 MascotDistiner软件扫描质谱峰的高度和坐标值，将上述数据输入Mascot数据库中搜索(~.matrixscience.com)，检索时各主要参数设置(表2一22):①数据库应用:swiss一Prot或NeB玩;②被鉴定样品的来源(speeies)，人类;③获得肤片段所选用的酶(enzyme)，胰蛋白酶;④修饰半肤氨酸所采用的试剂，脉甲基(carbamidomethyl一cys);⑤用于搜寻的质量与理论质量之间可允许的误差范围 (PePtideMassToleranee)

第三章结果 3.1TM组CSF图谱与正常组CSF图谱比较正常组与TM组CSFZ一DE图谱见图3一1、图3一2、图3一3。选择图3一1作为参考胶，将图3一2与其进行匹配。再选择图3一2作为参考胶，将图3一3与其进行匹配。结果测得正常组CSF有蛋白质斑点533个，，TM急性期CSF有蛋白质斑点546个。有14个蛋白质点仅在正常CSF中表达(图3一4)，有27个蛋白质点仅在TM急性期CSF中表达(图3一5)，这27个在TM急性期高丰度表达的蛋白质点，在TM治疗1个月后表达量均下调(图3一3);与正常CSF蛋白质点表达量比较，TM急性期CSF有8个蛋白质点表达量有2倍以上的下调(图3一6)
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R725.3

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本文编号：2652467