LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症单倍型分析及其外周血来源IPS-MSCs生物学特性研究

发布时间：2020-05-08 00:06

【摘要】：第一章广西新增的三例儿童早老症患儿的临床特征及致病基因分析目的:分析广西地区新增的两个儿童早老症家系3例儿童早老症患儿的临床特点,通过基因检测寻找突变位点,初步探索儿童早老症基因型与临床表型的关联性。方法:收集并分析广西地区新增的两个家系3例儿童早老症患儿的临床资料。对其中2例就诊的儿童早老症患儿进行皮肤活检病理检查。同时提取两个家系2代共9名成员的外周血DNA,对其LMNA基因12对外显子进行测序,寻找遗传学病因,分析基因型与临床表型的关联性。结果:3例患儿均具备典型的儿童早老症表型,包括身材矮小、皮肤硬化、皮下脂肪萎缩、骨质溶解、衰老面容、脱发等;除此,所有患儿均表现出近端指指关节固定屈曲畸形伴有远端指节的吸收变短。3例患儿的疾病发展模式相似,均在一岁之前出现症状且均以皮肤异常为首发症状,包括皮肤瘙痒、色素异常和(或)毛发脱落,症状随年龄增长逐渐加重。3例患儿均有血小板升高、血肌酐降低。皮肤病理均提示为硬皮病样改变。基因测序结果提示两个家系的3例患者均为1号染色体上的LMNA基因第9号外显子发生c.1579CT(p.R527C)纯合突变,其表型正常的同胞及父母为致病基因携带者。结论:广西地区新增的两个儿童早老症家系3例患儿均为LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症患儿。LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症的临床表型与其基因型存在相关性。第二章广西三个LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症家系致病基因所在染色体的单倍型分析目的:将广西地区发现的三个LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症家系两代(父母及子女)全部成员的遗传标记分型结果构建成单倍型进行分析,揭示三个家系致病基因是否来源于奠定者效应。方法:收集广西地区发现的三个LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症家系(本文研究发现的两个家系以及前期研究发现的另外一个家系)两代成员(患儿及父母)外周血,提取全基因组DNA,应用聚合酶链式反应(PCR)及毛细管电泳技术检测LMNA基因附近的微卫星位点(D1S498、D1S2714、D1S2721、D1Z10),将结果整理为单倍型进行分析。结果:三个家系R527C突变LMNA基因所在的染色体的微卫星标记D1S2721和D1Z10组合一致,大小均分别为243bp和115bp,正常未突变LMNA基因所在的染色体的微卫星标记D1S2721和D1Z10具有4种不同组合,且与致病基因所在染色体的组合不一致。结论:广西地区发现的三个LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症家系的1号染色体致病基因附近区域具有唯一一种特定单倍型,提示该三个家系致病基因的来源可能具有奠定者效应而并非人群中独立散发随机突变引起。第三章LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症患儿外周血来源IPS-MSCs的构建及生物学特性研究目的:通过对LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症患儿及健康对照者的外周血获得的诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞(IPS-MSCs)细胞系的构建及生物学特性研究,探索LMNA基因R527C纯合突变对IPSMSCs的影响,为后续研究奠定基础。方法:将LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症患儿(R527C组)及健康对照者(Control组)获得的外周血血细胞重新编程为IPS细胞,使用人类多能干细胞来源间充质干细胞分化试剂盒进一步分化为MSCs。通过流式细胞术检测MSCs细胞免疫表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD14、CD79a、HLA-DR。提取MSCs细胞DNA进行LMNA基因测序。使用成脂分化试剂盒及成骨分化试剂盒对MSCs进行成脂分化和成骨分化,并使用油红o染液及茜素红染液进行染色鉴定细胞分化潜能。通过LaminA和LaminB细胞免疫荧光检测MSCs细胞核形态。通过CCK-8法检测MSCs的增殖情况。流式细胞术检测MSCs的凋亡情况。使用SA-β-gal染色试剂盒检测MSCs细胞的衰老情况。Western Blot检测p21及γ-H2AX蛋白的表达情况。RT-qPCR检测炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23、TNF-α的mRNA表达水平及衰老相关蛋白p16、p21、p53的mRNA表达水平。结果:两组外周血来源IPS-MSCs细胞表面均高表达CD73、CD90和CD105,CD34、CD45、CD14、CD79a、HLA-DR均表达阴性。LMNA基因测序显示R527C组外周血来源IPS-MSCs存在LMNA基因R527C纯合突变,而Control组的LMNA基因无变异。成脂及成骨分化及染色鉴定显示两组外周血来源的IPS-MSCs均具有分化潜能。免疫荧光显示两组IPSMSCs均表达LaminA和LaminB蛋白,且R527C组细胞核明显弯曲、变形。R527C组外周血来源IPS-MSCs增殖缓慢,增值率从第2天开始较健康对照组明显下降(p0.05);细胞凋亡增加,早期凋亡及晚期凋亡比例均增加,以早期凋亡更为显著(p0.05);SA-β-gal染色显示衰老细胞阳性率升高;IL-1β、IL-6、IL-8、IL-23炎症因子及衰老标志物p16、p21的mRNA水平表达增加(p0.05);wb显示p21蛋白表达增加(p0.05),但DNA损伤标志物γ-H2AX表达无差异(p0.05)。结论:我们成功构建了LMNA基因R527C纯合突变儿童早老症外周血来源IPS-MSCs模型,并发现其生物学特性与健康对照组存在明显差异,为进一步的机制探索及干预研究奠定了基础。
【图文】：

病例,患儿,站姿,秃发

图 1-1 早老症患儿的临床表型（A-D 为病例 1；E-H 为病例 2；I-K 为病例 3）；A、E：身材矮小、骑马样站姿；B、F、I：秃发、眉毛缺失、小下颌、尖鼻等早老面容；C、G、J：患儿双手近端指指关节严重屈曲畸形，指节吸收、变短、缺如，手背皮肤硬化、色素加深；D、H、K：双下皮肤硬化、色素加深、皮下脂肪萎缩、散在溃疡，膝关节屈曲固定。Fig1-1 The clinical phenotype of the patients with progeria syndrome图 1-2 早老症患儿影像学特点（病例 1 患儿） A：梨形胸、锁骨发育不全或溶解；B-D：四肢密度减少、部分骨质缺损。Fig 1-2 The X-ray of the patientwith progeria syndrome依据 2009 年首都儿科研究所生长发育研究室制作的儿童青少年身高

患儿,病例,发育不全,锁骨

图 1-1 早老症患儿的临床表型（A-D 为病例 1；E-H 为病例 2；I-K 为病例 3）；A、E：身材矮小、骑马样站姿；B、F、I：秃发、眉毛缺失、小下颌、尖鼻等早老面容；C、G、J：患儿双手近端指指关节严重屈曲畸形，指节吸收、变短、缺如，，手背皮肤硬化、色素加深；D、H、K：双下肢皮肤硬化、色素加深、皮下脂肪萎缩、散在溃疡，膝关节屈曲固定。Fig1-1 The clinical phenotype of the patients with progeria syndrome
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.9

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