Notch在小鼠神经管畸形形成中的作用及分子机制的初步研究

发布时间：2020-05-16 09:03

【摘要】： 目的 探讨Notch信号在正常神经上皮发育及神经管发育过程中的作用,试图揭示Notch信号通路在神经管畸形发生过程中的分子机制,为进一步探讨Notch信号在胚胎神经系统发生和发育过程中的作用及可能的机制提供实验依据。 方法 采用全胚胎原位杂交技术观察到Notch在正常胚胎早期发育中时空表达规律,尤其在神经胚形成阶段;利用喂服过量全反式维甲酸(alltransretinoic acid,ATRA)诱导NTDs模型,观察NTDs的胚胎早期发育过程中Notch的表达变化:采用RT-PCR技术检测Notch信号调节的发育相关基因在正异常鼠胚的表达;并利用Western blots观察Notch蛋白的胞内活性形式NICD(the intracellular domain of Notch)胚胎早期发育中的变化。 结果 一、Notch在小鼠神经胚发育中的表达 采用全胚胎原位杂交可观察到在小鼠胚胎发育的9.5～11.5天(E9.5d～E11.5d)NotchmRNA的表达情况,阳性反应物成黄绿色。在E9.5d随着神经管的逐渐关闭,Notch mRNA在前脑泡有表达,尾部也有少许表达,到E10.5d,阳性信号由前脑泡转移至中脑泡乃至整个脊柱,E11.5d时在整个脑泡以及脊柱中仍有Notch mRNA的表达,但表达强度不如E10.5d的强。 二、Notch与ATRA致小鼠NTDs的关系 与正常对照组相比,喂服ATRA后的孕鼠在E9.5～10.5d可观察到前脑顶部和后脑未闭合的畸形胚胎,在少数胚胎可观察到整个神经管未闭合,呈开放状态。表明该剂量的ATRA(50mg/kg)可以造成CNS发育的缺陷。 与正常鼠胚相比,ATRA致NTDs鼠胚在E9.5d Notch mRNA的表达量要比正常的鼠胚明显增多,而且表达部位也有增加,不仅在前脑泡有表达,在未完全形成的脊柱上也有表达;E10.5d Notch mRNA的表达量较正常鼠胚减少,在脑泡Notch mRNA.表达的阳性信号要弱于正常鼠胚;E11.5d胚胎神经管关闭,Notch mRNA的表达与正常鼠胚相比无论表达量还是表达部位都没有明显变化。 三、Notch信号调节的发育相关基因的表达 通过凝胶图像分析,计算所得灰度比值来反映各基因mRNA的表达,将对照组(正常神经管组织)和NTDs组行两样本t检验,得出NTDs组与对照组组内各样本间无差异(P＞0.05);E9.5d时Notchl在NTDs组表达高于对照组(P＜0.05),其它三个基因RBP-Jk、PS1、Hes1在NTDs组和对照组间无统计学意义;E10.5d时Notchl和RBP-Jk的表达在对照组和NTDs组没有统计学意义(P＞0.05),而PS1和Hes1的表达存在差异,PS1和Hes1在NTDs中的表达明显低于对照组,具统计学意义(P＜0.05);E11.5d,四个基因均未有差异表达。在正常神经管组织中,胚胎发育不同时间(E9.5-11.5d)Notchl的表达在E10.5d高于E9.5d,但与E11.5相近;RBP-Jk的表达在E10.5d高于E9.5d和E11.5d;Hes1的表达也是如此;而PS1随天数表达增加;在ATRA致小鼠NTDs神经管组织中,Notchl和RBP-Jk的表达在E9.5-11.5d几天内没有较大的变化;PS1的表达在E9.5-11.5d内,降低后增高,Hes1的表达也是先降低后增加。 四、Notch蛋白胞内区NICD的定量 采用凝胶成像及分析系统,于可见光下采集蛋白条带图像,通过与相应内参GAPDH条带密度比较,计算各个条带密度相对比值。以此比值来反映NICD蛋白的表达量。对所获得的数据采用SPSS 11.5统计学软件进行统计学处理。将各期对照组(正常脑组织)和NTDs组行两样本t检验,得出E9.5d时NICD的表达没有统计学意义P＞0.05,而E10.5d时NICD蛋白表达在同期对照组和NTDs组有显著差异P＜0.05,到E11.5d时核内NICD的变化不大,没有差异。免疫组化显示Notch胞内区NICD在神经管周围神经上皮中有表达。 目的 探讨山西省汉族人群MTHFRC677T、RFC-1A80G基因多态性状况及与神经管畸形(Neural Tube Defects简称NTDs)的相关性，明确山西神经管畸形发病的危险因素，为预防和控制NTDs发生提供科学的依据。 方法 采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)分析38例曾经生育过NTDs．儿妇女和80例正常对照的MTHFRC677T和RFC-1A80G多态性分布。根据Van Allen's分类法将神经管畸形分为高畸形组(包括腰椎或腰骶脊柱裂)和低畸形组(包括无脑，枕部脑膨出)。 结果 1．病例组与对照组相比：MTHFR基因677位点基因型频率没有差别；并且二者在等位基因频率上也无显著差异。但是在生育低畸形儿母亲组T等位基因频率高于对照组，具有统计学意义(OR=0．32(95％CI0．11-0．9)，p=0．027)：677T／T基因型频率在生育低畸形儿组与对照组中没有显著差异p=0．08。 2．病例组与对照组相比：RFC-1 80位点基因型频率存在统计学意义，OR=8．85(95％CI 1．70-44．3，)，p=0．008，生育畸形儿母亲组(病例组)G等位基因频率为47％要高于对照组32％，且有统计学意义(P=0．021，OR=1．97，，95％CI=1．12-3．44)：生育高畸形儿母亲组和对照组相比基因型频率AG和AA存在显著差异(p=0．009，OR=6．7，95％CI=1．47-30．9)，GG和AA存在显著差异(P=0．005，OR=20．6，95％CI=163．8)。而在生育低畸形儿母亲组没有统计学意义。 结论 1．MTHFRC677T突变尚不能被看作是山西地区汉族人群神经管畸形发病的独立遗传因素； 2．RFC-1A80G单核苷酸多态性可能与山西地区汉族人群神经管畸形遗传易感性有关。
【图文】：

山西医科大学硕十学位论文图1一2一 AEg.sd全胚胎原位杂交示 NotchmRNA图1一2一 BE10.sd全胚胎原位杂交示 NotchmRNA图1一2一 CEll.sd全胚胎原位杂交示 NotchmRNA4讨论神经管的发生是一个多因素参与的高度复杂的胚胎学事件，从片层状的外胚层神经板逐渐演变为长管状神经管的过程又称为神经胚形成(neurulation)。形成神经管的神经上皮细胞源于神经外胚层细胞，神经外胚层原神经基因的活动将导致神经系统大部分表层的形成。这一过程可以被神经源基因(原神经基因)的作用所抑制，神经源基因编码一种被外胚层细胞应用、限制神经祖细胞数量的细胞通讯机制蛋白。神经源基因功能缺失将导致扩展的表皮祖细胞上神经祖细胞数量增加，其中Notch为编码膜蛋白的神经源基因。本实验采用全胚胎原位杂交技术，对整个胚胎进行原位杂交，观察目的基因Notch的表达、分布等时空变化，此法组织定位准确也更经济。我们检测了E9.5一 11.sd神经胚形成过程中 NotchmRNA表达情况，发现Eg.sd时整个鼠胚只有前脑泡和尾部有表达

吸收胎较多。解剖显微镜下观察到胚胎发育迟缓，死胎明显增多，形态多样，主要为前脑顶部和后脑未闭合，在少数胚胎可发现整个神经管未闭合，呈开放状态。 El1.5d以后的孕鼠子宫多恢复正常状态，吸收胎减少。(如图1一4) 123图1一3正常小鼠胚胎1为E&sd小鼠胚胎，胚体尚未完全转体，神经管没有闭合;2为Eg.sd鼠胚;3为 EI0.5鼠胚图1一 4NTDs鼠胚，表现为露脑、无脑、脊柱裂 1.3.2NTDs鼠胚 NofchmRNA全胚胎原位杂交检测结果:与正常鼠胚相比，ATRA致NTDs鼠胚在 Eg.sdNotchmRNA的表达量要比正常的鼠胚明显增多，而且表达部位也增加，不仅在前脑泡有表达，在体节上也有表达(见图1一5一A)，而正常鼠胚在E10.sd时在体节中才有Notch的表达;NTDs鼠胚E10.sdNotchmRNA的表达量较正常鼠胚减少，在脑泡 NotchmRNA表达的阳性信号要弱于正常鼠胚(见图卜5一B);Ell.sd胚胎神经管关闭，NotchmRNA的表达与正常鼠胚相比无论表达量
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R748

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 谢雄伟;马树人;;激活Notch信号的骨髓间充质干细胞心肌移植促进血管新生[J];江苏医药;2011年14期

2 范任华;陈平圣;赵迪;李静;吴楠;刘凤;;失调的Notch信号与癌基因ras共同促进肝细胞转化与增殖[J];东南大学学报(医学版);2011年04期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相关会议论文 前4条

1 谢雄伟;庄汉屏;唐凤英;;激活Notch信号骨髓间充质干细胞移植改善心肌梗死模型大鼠心功能的研究[A];中华医学会第九次全国老年医学学术会议暨第三届全国老年动脉硬化与周围血管疾病专题研讨会论文汇编[C];2009年

2 齐润姿;安华章;于益芝;张明徽;刘书逊;徐红梅;曹雪涛;;Notch1和TRAIL对肝癌细胞凋亡的影响及作用机制的研究[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

3 齐润姿;安华章;修方明;于益芝;张明徽;刘书逊;曹雪涛;;Notch1对肝癌细胞生长的影响及作用机制的研究[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

4 ;Delayed Primary Vitreous Regression in Jaggedl Mutant Mice[A];中国实验动物学会青年科技协会第二届学术研讨会论文汇编[C];2001年

相关博士学位论文 前10条

1 鲁茁壮;Notch信号促进造血干/祖细胞扩增及间充质干细胞向成骨细胞分化的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年

2 晋金兰;骨髓间充质干细胞向心肌细胞和内皮细胞分化的研究[D];中南大学;2009年

3 邢书亮;毛囊干细胞向上皮细胞分化及其相关调控信号的初步研究[D];复旦大学;2007年

4 隋立森;大鼠颅脑损伤后神经干细胞原位诱导、增殖分化及Notch信号通路调控机制的实验研究[D];南方医科大学;2008年

5 张斌;骨髓来源Flk-1~+间充质干细胞免疫调节机制的相关研究[D];中国协和医科大学;2008年

6 焦淑洁;血管内皮生长因子在人胚胎干细胞神经分化过程中的作用及相关机制研究[D];华中科技大学;2009年

7 谢雄伟;激活Notch信号的骨髓间充质干细胞心肌移植治疗心梗模型鼠的实验研究[D];中南大学;2009年

8 高娟;Notch信号通路在肝癌发生发展中的作用及机制研究[D];第四军医大学;2007年

9 张明芳;RNAi沉默Notch1、Notch2对人胶质瘤U251细胞增殖的影响及其机制[D];福建医科大学;2010年

10 陆群;牙髓干细胞分离培养鉴定和体外诱导分化的研究[D];第四军医大学;2002年

相关硕士学位论文 前6条

1 商亚丽;Notch在小鼠神经管畸形形成中的作用及分子机制的初步研究[D];山西医科大学;2007年

2 张丽;Notch信号在急性白血病患者骨髓中的表达[D];第四军医大学;2009年

3 鲁友明;内皮祖细胞对神经干细胞增殖分化及Notch信号分子表达的影响[D];南昌大学;2008年

4 何飞;Notch信号在体外牙髓细胞分化中的表达及其调控的实验研究[D];第三军医大学;2001年

5 李斌;Notch 1在人脑胶质细胞瘤中的表达及其胞内段真核表达载体的构建[D];第四军医大学;2008年

6 董芳;Ad-GFP-NICD转染对人脐带间充质干细胞促动脉形成潜能影响[D];兰州大学;2011年

本文编号：2666494