神经肽P物质调控高氧损伤早产鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞修复的信号机制

发布时间：2020-05-16 10:58

【摘要】： 低氧血症是危重新生儿常见的临床表现,严重时可危及生命。氧疗是改善新生儿缺氧状态的重要治疗方法,在新生儿特别是早产儿,由于肺发育不成熟,肺间质和肺泡分化不全,肺弹力纤维和结缔组织发育不良,未成熟肺长时间暴露于高氧下会导致肺上皮细胞损伤、死亡、急性肺损伤(Acute lung injury, ALI)甚至呼吸功能衰竭致支气管肺发育不良( bronchopulmonary dysplasion ,BPD)。近年来BPD在全球发病率逐年增高,存活者常伴有明显肺发育障碍和功能低下,目前国际上尚无确定有效的防治方法,但大量临床资料显示高浓度吸氧、长时间氧疗是导致BPD的高危因素,其病因与高氧性肺损伤密切相关。当前国内外研究主要集中在如下几个方面①尝试用肺表面活性物质蛋白(SP-A)弥补损伤的AECⅡ功能,但SP-A生物提成困难,远期效果不尽理想,②也有学者企图通过上皮干细胞定向分化为AECⅡ再移植给肺损伤的病人,但未解决细胞分化、培养、体内生长调控等问题,③利用基因工程技术所生产的生长因子药物如表皮生长因子(EGF),碱性成纤维细胞因子(bFGF),神经生长因子(NGF)虽较好地应用于体表创烧伤患者的修复重建,但目前尚不能在肺损伤的主动修复重建中应用。④虽发现转化生长因子(TGF-β)和干扰素(INF-γ)在肌成纤微细胞的转型异常中分别起正负调控作用,但两者相互拮抗的机制并不清楚。⑤虽发现细胞外基质(ECM)的积聚在肺纤维化发展过程中的作用,然而目前尚无有效方法阻止ECM的积聚⑥由于肺损伤后AECⅡ修复重建的一系列病理生理变化仍不清,因而现今临床上采用的多种治疗方法如:更换机械通气模式、激素、表面活性物质替代疗法、免疫疗法等均收效甚微。回顾以往的研究多集中在如何阻断有害因素对AECⅡ的损害,而对损伤后如何保护和促进AECⅡ修复重建研究甚少,近年的研究发现,肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial typeⅡcells,AECⅡ)存活和凋亡变化可能参与高氧肺损伤的发展和转归,影响肺损伤修复的结局。如果早期干预AECⅡ的凋亡变化就可能减轻肺上皮细胞损伤,从而逆转肺损伤,并阻断后续的肺间质增生和肺组织纤维化。AECⅡ的主动修复理论是近年来研究的热点,寻找促进AECⅡ主动修复的新型调控因子成为高氧性肺损伤防治的新切入点。近年来由肺神经内分泌细胞(Pulmonary neuroendocrine cell,PNECs)分泌的感觉神经肽类递质的作用开始被注意,神经肽类递质(Neuropeptides,Ne )是一种细胞调控因子或细胞外信使分子,是神经、内分泌和免疫共同识别的信号物质之一,“神经?体液?免疫”网络对创伤修复过程起调控作用。神经肽P物质(substance P,SP)是最早发现的速激肽家族神经肽,广泛分布于气道上皮细胞层内、肺血管、气管、支气管平滑肌层内及腺体和支气管神经节周围,新近研究表明SP在修复细胞的增殖、迁移、分化方面有重要作用,SP对角质细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、血管内皮细胞均有明显的促增殖分化作用,呼吸器官含有丰富的SP,而其对高氧肺损伤AECⅡ修复作用尚不清楚。细胞凋亡是基因调控下细胞积极死亡的形式,往往涉及一些信号途径的参与,假如SP是AECⅡ新的调控因子,那么它是通过什么分子机制来现实这一调控过程?丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases , MAPKs )途径,包括细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase ,ERK),c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和P38激酶(P38MAPK),是细胞增殖、分化等信息传递途径的交汇点和共同通路。SP能否促进高氧后损伤的AECⅡ的修复,且是否与调控MAPKs有关,目前尚不清楚。综上所述,SP作为重要的感觉神经肽类递质,可能通过MAPK途径参与高氧性肺损伤AECⅡ的修复,从而减轻高氧性损伤,将是未来高氧ALI和BPD防治的可行性途径。本课题以原代培养的早产鼠AECⅡ为研究对象,通过建立体外细胞氧化损伤模型,观察高氧暴露不同时间及SP干预对AECⅡ增殖存活的影响及MAPKs的调控机制。第一部分原代早产大鼠肺泡II型上皮细胞分离、纯化、培养及鉴定背景氧气疗法是临床上治疗新生儿急性呼吸衰竭常用且有效的措施,但长时间高氧暴露可引起氧化应激性肺损伤。高浓度氧气(氧气体积分数950ml/L,简称高氧)暴露是导致氧化应激性肺损伤的主要致病因素。高氧肺损伤是弥散性肺泡炎和损伤后修复重建的复杂病理生理过程,其治疗的根本难题在于内源性肺泡上皮不能恢复,肺组织修复过程中不是由正常的肺泡上皮替代,而是由成纤维细胞替代导致肺组织修复障碍。肺泡上皮损伤后修复主要依赖于肺泡上皮的干细胞——AECⅡ的增殖和分化以覆盖肺泡表面,完成肺泡的修复。AECⅡ体积较小、呈立方形,占肺泡上皮细胞数的60%左右,能通过增殖、铺展、迁移,并最终转化为肺泡I型上皮细胞(Alveolar type I epithelial cells, AEC I ),恢复肺泡上皮正常的形态和功能。胎肺发育晚期肺组织主要由AECⅡ和肺成纤维细胞(Lung fibroblast ,LF)组成,因此胎肺AECⅡ和LF的分离、纯化和原代培养对体外研究肺发育和早产儿肺部疾病至关重要,但早产大鼠AECⅡ细胞的原代分离、纯化技术难度大,培养条件相对要求高;特别是AECⅡ不能传代培养,分离高纯度的细胞仍有较大困难。本研究的目的是掌握早产大鼠AECⅡ的分离、纯化和培养技术,以获得数量足够、纯度高的AECⅡ,满足下一步实验的需要。目的确定早产大鼠原代AECⅡ分离、纯化、培养的技术方法,为研究高氧刺激下AECⅡ存活、凋亡和信号转导机制提供数量足够和高纯度的AECⅡ,以满足实验的需要。方法成年SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠,购自第三军医大学大坪三院实验动物中心。雌雄按1:1合笼交配,找到阴栓日计为妊娠第1天。取胎龄19天的早产鼠分离AECⅡ,步骤如下:水合氯醛麻醉孕19天大鼠,剖宫取出胎鼠,分离胎肺,去除气管、支气管等非肺组织后剪至1mm3大小,加入0.25%胰酶消化25-30分钟,完全培养基终止消化。100目筛网过滤,滤液800rpm离心后弃上清,沉淀加入0.1%的胶原酶Ⅰ消化45分钟后离心去上清,沉淀重悬在含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中,接种至培养瓶,培养30分钟后贴壁的为LF,未贴壁的为AECⅡ,吸出,800rpm离心后接种至新的培养瓶。如此反复贴壁3次,以纯化AECⅡ。最后未贴壁的细胞按浓度1.5×106/ml接种至6孔培养板,培养12小时后弃除未贴壁的细胞,此时贴附在瓶底的细胞即为AECⅡ。继续接种于6孔培养板或96孔培养板,更换新鲜培养液继续培养12h备用。台盼蓝拒染法测定细胞活力、改良巴氏染色法确定细胞纯度、透射电镜(Transmitting electron microscopy, TEM)鉴定细胞;在体外培养细胞不同的时间(12、24、和48h)观察细胞的性状和形态变化。结果 1.每3-5只19天胎龄早产鼠经分离培养可获AECⅡ数约为(36±5)×106。 2.台盼蓝拒染法测定细胞活力 90%。 3.改良巴氏染色法证实细胞纯度 90%。 4.电镜下观察到AECⅡ典型细胞结构——板层小体。 5.体外培养12至24 h时AECⅡ生长良好,细胞质内有较多颗粒;48h以后细胞呈长索形,细胞内颗粒减少,并出现空泡。结论本实验观察到19d胎鼠AECⅡ原代培养12h ,接近融合状态,原代培养第24～48h,增殖代谢旺盛,生长状态最佳,可获得高产量、高纯度、高活力的原代AECⅡ,此时适合做体外研究。第二部分高氧暴露及神经肽P物质干预对早产大鼠肺泡II型上皮细胞的影响背景氧疗是临床上用于提高血氧饱和度、改善组织缺氧状态的一种辅助治疗手段,高浓度氧气(氧气体积分数 950ml/L,简称高氧)机械通气是治疗严重呼吸衰竭(Respiratory failure,RF),尤其是急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)的常用措施,但常时间暴露在高氧状态下可产生过量的活性氧自由基(Reactive oxygen species ,ROS),引起细胞内氧化/抗氧化体系失衡而导致氧化应激性肺损伤,引起早产儿肺发育受阻,形成早产儿BPD。如何促进高氧损伤后的修复,防治BPD是临床工作者十分关注的问题。高氧肺损伤时,由于AECI较AECII更易受高浓度氧的损伤,首先受到破坏,AECⅡ是肺组织中的重要细胞,在肺泡受到损伤时能转化为AECI修复受损肺泡,由于AECI是高度分化的细胞,不可能再生,所以肺泡的损伤修复完全依赖于AECⅡ的增殖分化。近年研究发现,在肺发育关键阶段,高氧可引起肺的重塑及生长异常,其中一个主要因素是其导致了AECII的凋亡。但细胞凋亡在高氧肺损伤中的作用仍不清楚,多数学者报道高氧诱导的细胞凋亡与肺损伤的程度成正相关。另外,对于细胞凋亡与肺纤维化关系的研究表明,肺泡和细支气管上皮细胞的凋亡可能是导致肺纤维化的一种机制。据此推测如果采取一定措施防止AECII的凋亡,增加AECII增值、移行,可能对高氧肺损伤后的BPD起到防治作用以往的研究多集中在如何阻断有害因素对AECⅡ的损害,更多的重视免疫源性因素如炎症细胞、细胞因子对创伤修复的影响,而对损伤后如何保护和促进AECⅡ修复重建研究甚少,忽视了“神经?体液?免疫”网络对修复过程的调控。故寻找促进AECⅡ主动修复的新型调控因子成为高氧性肺损伤防治的新切入点。神经肽类递质(Neuropeptides,Ne )是一种细胞调控因子或细胞外信使分子,是神经、内分泌和免疫共同识别的信号物质之一。新近研究表明感觉神经肽SP在修复细胞的增殖、迁移、分化方面有重要作用,在成体皮肤创伤愈合中已证实SP不仅启动愈合早期的神经源性炎性反应,同时对修复细胞增殖、再生和瘢痕形成密切相;气道SP主要来自感觉神经c-纤维末端,分布于气道上皮细胞层内、肺血管、气管、支气管平滑肌层内及腺体和支气管神经节周围。气道神经内分泌细胞、平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和肺泡巨噬细胞都能合成和分泌SP;SP特异性受体可见于气道平滑肌、粘膜下腺、血管内皮,一些炎性细胞也表达SP受体。呼吸器官含有丰富的SP,但其在肺损伤修复中的地位和作用国内外尚无相关报道。本部分研究高氧暴露不同时间及SP干预对AECⅡ增殖存活的影响和高氧暴露不同时间早产鼠肺组织SP含量的动态变化。目的 1.采用高氧和无血清培养基建立原代早产大鼠AECⅡ的氧化损伤模型。 2.研究高氧暴露不同时间及SP干预对AECⅡ形态、膜脂质过氧化程度指标丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(TAOC)、存活和凋亡的影响,探讨AECⅡ损伤与高氧作用的时间效应关系及SP干预对AECⅡ损伤的作用。 3.早产鼠高氧肺损伤动物模型的制备及SP含量的测定。方法 1.分离、纯化清洁级Spraque-Dawley早产大鼠的AECⅡ,台盼兰拒染法鉴定细胞活性,改良巴氏染色法鉴定细胞纯度。将AECⅡ随机分为:空气暴露组、高氧暴露组、SP干预空气暴露组、SP干预高氧暴露组,空气暴露组氧体积分数为210ml/L,高氧暴露组氧体积分数为950ml/L),SP干预组于暴露前加入SP 1×10-6mol/L,在置于氧体积分数为210ml/L和950ml/L中各组分别暴露12、24、和48h,电镜观察AECⅡ的形态变化;采用分光光度计测定各组丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(TOAC)浓度;噻唑兰检测法(MTT法)及流式细胞仪测定其增殖率和凋亡率,以明确细胞损伤与高氧作用的时间效应关系及SP干预对AECⅡ损伤的作用。 2.剖宫取出SD大鼠孕2l d(足月为22 d)早产鼠,随机分为空气暴露组和高氧暴露组,空气暴露组氧体积分数为210ml/L,高氧暴露组氧体积分数为950ml/L,分别于暴露3,7,14 d后,取肺组织测定其SP含量。结果 1.与空气暴露组相比,AECⅡ高氧暴露后12h,细胞间隙稍增宽,部分细胞内可见反光增强的空泡;高氧暴露后24h,细胞间隙增宽,细胞体积减小,胞内空泡增多,部分细胞核浓缩变小,细胞内颗粒(板层小体)减少;高氧暴露后48h,大量细胞变圆、皱缩明显,细胞脱壁,培养上清液中可见漂浮的细胞和细胞碎片;透射电镜下可观察到典型的凋亡细胞(细胞体积变小,细胞质浓缩,胞膜内陷,细胞核固缩,核染色质浓缩并凝结成块)和凋亡小体围绕。与空气暴露组比较,发现随高氧暴露时间的延长,细胞的形态损害随之加重。而SP干预后高氧暴露12、24及48h,较高氧暴露组同时间点比较细胞器变化减轻。 2.高氧暴露及SP干预高氧暴露12、24及48h对AECⅡ氧化损伤的影响:与空气组比较,高氧组12、24及48h TAOC显著下降,MDA明显升高,而与SP干预高氧暴露组比较,其TAOC仍低于空气组,但较高氧组明显升高,同时MDA虽高于空气组,但较高氧组明显降低。 3. MTT实验结果表明:与空气暴露组比较,高氧暴露组12、24及48h AECⅡ增殖活性显著下降,AECⅡ存活率呈下降明显(P 0.05)。随作用时间的延长,细胞存活率逐渐下降,各组间比较有显著差异(P 0.05)。而与SP干预高氧暴露组比较,其增殖活性仍低于空气暴露组,但较高氧暴露组明显升高。 4.流式细胞仪检测细胞周期检测AECⅡ凋亡结果显示:与空气暴露组比较,高氧暴露组12、24及48h,随高氧作用时间的延长, AECⅡ凋亡率呈明显上升趋势(P 0.05)。而与SP干预高氧暴露组比较,同时间点凋亡率虽高于空气暴露组,但较高氧暴露组明显降低。 5.与空气暴露组比较,高氧暴露3、7、14 d早产鼠肺组织SP含量显著降低(P0.01),且随高氧暴露的延长,SP含量降低明显(高氧暴露组间比较,P0.01)。结论 1.高氧刺激可诱导AECⅡ发生凋亡,并以时间依赖的方式加重AECⅡ损伤。 2. SP干预后可减少MDA产生,提高TAOC水平,提示SP干预后可增加机体AOE的活性,使氧化和抗氧化失衡状态得到纠正,有助于减轻和耐受高氧肺损伤。 3. SP干预后可减少高氧所致AECⅡ的凋亡率增加存活率,提示SP可以减轻AECⅡ的氧化损伤,对氧化应激状态下的AECⅡ可能起到保护作用。 4.高氧暴露可导致SP含量的动态变化,提示高氧暴露后导致气道感觉神经c-纤维末端SP分泌不足,局部SP含量的降低可能与AECⅡ的损伤程度有关。第三部分高氧暴露及神经肽P物质干预调控早产大鼠肺泡II型上皮细胞修复的MAPKs信号机制背景氧气疗法是临床上治疗急性呼吸衰竭常用且有效的措施,但长时间吸人高浓度氧,肺直接暴露于高氧中,引起肺泡毛细血管通透性增高、肺泡液渗出增多、炎性损伤、纤维蛋白沉积及肺表面活性物质活性降低等非特异性改变,引起氧化应激性肺损伤致BPD,BPD是早产儿长时间吸入高体积分数氧(高氧)治疗的常见并发症。第二部分证实了高氧以时间依赖的方式诱导AECⅡ损伤,高氧刺激可诱导AECⅡ发生凋亡;SP干预后可减少高氧所致AECⅡ的凋亡率增加存活率,对氧化应激状态下的AECⅡ可能起到保护作用。细胞凋亡是基因调控下细胞积极死亡的形式,往往涉及一些信号途径的参与,SP是AECⅡ新的调控因子,那么它是通过什么分子机制来实现这一调控过程?丝裂原活化蛋白激酶(mitogen.activated protein kinases,MAPKs)信号传递通路在介导高氧肺损伤过程中扮演重要角色,MAPKs主要包括3个家族成员:胞外信号调节激酶(extracellular si gna 1-regulated kinases,ERKs),C-JUN氨基端激(C-JUN-NH2.terminal kinases,JNKs)和p38激酶。目前认为,MAPK信号通路是细胞外的各种信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要通道,能被多种刺激因素激活而介导细胞的凋亡。MAPKs是细胞应激反应、增殖、分化和凋亡等信息传递途径的交汇点和共同通路,细胞外各种刺激信号可通过细胞内不同的信息传递通路,共同交汇于MAPKs。已有研究证实,暴露于95%氧气以及H2O2应激可触发转录因子AP-1及MAPK家族p38、JNK成员的持续激活,从而介导高氧所致肿胀性细胞死亡以及细胞凋亡,且细胞的存活率在特异性抑制剂抑制MAPK活化的同时得到明显的改善;维甲酸通过调控MAPK途径减轻早产大鼠高氧肺损伤。MAPKs通路参与了高氧氧化应激下AECⅡ凋亡信号转导,并对AECⅡ起促凋亡的作用。SP干预是否也可以通过MAPKs通路,对AECⅡ的凋亡存活产生影响?其调控机制尚不清楚。本部分进一步研究高氧暴露及SP干预对原代培养的AECⅡ的损伤及保护中是否有MAPK信号的参与及MAPK信号的调控机制。目的 1.采用高氧和无血清培养基建立原代早产大鼠AECⅡ的氧化损伤性细胞模型。 2.研究高氧暴露不同时间及SP干预对AECⅡ形态、存活和凋亡的影响,探讨AECⅡ损伤与高氧作用的时间效应关系及SP干预对AECⅡ损伤的作用。 3.研究高氧氧化应激及SP干预下AECⅡ凋亡过程中MAPKs的活化情况,从而研究MAPKs对AECⅡ凋亡的作用及SP干预后对MAPKs信号机制的调控。方法分离、纯化清洁级Spraque-Dawley早产大鼠的AECⅡ,台盼兰拒染法鉴定细胞活性,改良巴氏染色法鉴定细胞纯度。将AECⅡ随机分为:空气暴露组、高氧暴露组、SP干预空气暴露组、SP干预高氧暴露组,空气暴露组氧体积分数为210ml/L,高氧暴露组氧体积分数为950ml/L ,SP干预组于暴露前加入SP 1×10-6mol/L,在置于氧体积分数为210ml/L和950ml/L中各组分别暴露12、24、和48h,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各组各时间点磷酸化总ERKs、JNKs或p38表达。结果 1.高氧暴露后AECⅡ12、24及48h ,发现高氧暴露刺激后很快诱导p-ERK表达,12、24及48h时p-ERK表达与空气暴露组相比显著增加,其中48h时p-ERK蛋白条带表达最强, SP干预后高氧暴露12、24及48h,较高氧组同时间点比较p-ERK表达更明显。 2.高氧暴露后AECⅡ12、24及48h ,发现高氧暴露刺激后很快诱导p- p38表达,12、24及48h时p- p38表达与空气暴露组相比显著增加,其中48h时p- p38蛋白条带表达最强, SP干预后高氧暴露12、24及48h,较高氧组同时间点比较p- p38表达减弱。 3.高氧暴露后AECⅡ12、24及48h ,发现高氧暴露刺激后很快诱导p-JNK表达,12、24及48h时p-JNK表达与空气暴露组相比显著增加,其中48h时p-JNK蛋白条带表达最强,SP干预后高氧暴露12、24及48h,较高氧暴露组同时间点比较p-JNK表达减弱。结论本研究发现高氧暴露刺激AECⅡ后能很快诱导MAPKs表达,在48h左右达到峰值,使用SP干预MAPKs信号通路后,在高氧刺激下SP干预组细胞的凋亡率明显低于高氧组的凋亡率,而其细胞存活率明显高于高氧组的存活率,说明MAPKs信号介导了AECⅡ的凋亡,SP干预后进一步激活胞外信号调节激酶并抑制C-JUN氨基端激酶和p38激酶信号激活对氧化应激状态下的AECⅡ有保护作用。
【图文】：

台盼蓝染色

图 1 台盼蓝染色(×100)Fig 1 Trypan blue staining of AECⅡ cells(×100)CⅡ在体外培养 12 小时 B： AECⅡ在体外

形态变化,分裂期

C：AECⅡ在体外培养 48 小时图 2 在体外培养不同时间后 AEFig 2 The morphological changes of primary AECpurifiation in vitro注：示分裂期
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R722.6

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