P-糖蛋白170与原发性肾病综合征患儿糖皮质激素耐药的临床病理相关研究

发布时间：2020-05-16 14:25

【摘要】： 【研究背景】肾病综合征(Nephrotic Syndrome，NS)在小儿肾脏疾病中发病率仅次于急性肾炎，是小儿时期较为常见的一种肾脏疾病。1990年小儿肾脏病科研协作组调查结果显示，儿童NS占同期泌尿系统疾病住院患儿的21％，而原发性肾病综合征(Primary Nephrotic Syndrome，PNS)约占小儿时期NS的90％。迄今为止，糖皮质激素(glucocorticoid，GC)仍为最基本的治疗药物之一，NS患儿对GC治疗的反应性是决定其疾病转归极为重要的因素。临床研究表明，近80％的NS患儿初发病时对GC敏感，另20％应用足量GC后仍对GC无反应，称为GC耐药或抵抗。另外，随访发现GC敏感NS患儿中，有50％-60％在治疗过程中变为频复发，直至对GC依赖。GC抵抗型患儿病情容易复发或勤复发促进了肾脏病理损害的慢性进展，使最终发展为终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)的几率增加，故GC耐药机制一直是研究的热点问题。然而到目前为止，NS患儿对GC治疗抵抗的机制仍不甚明了。经典的与GC耐药有关的发现集中于GC受体(glucocorticoid receptor，GR)分子结构和数量的改变、GR基因多态性、GR两种亚型GRa、GRβ的表达失平衡等方面，而GR的异常影响的是GC与GR结合及结合以后的效应阶段，对GC与GR结合之前阶段的研究知之甚少。近年来，学者们发现多药耐药基因(multidrug resistant 1，MDR1)基因产物P-蛋白170(P-glycoprotein170，P-gp170)参与介导了多种肿瘤、免疫性疾病等的GC耐药。大多研究认为P-gp170是体内广泛存在于细胞膜表面的一种药物转运泵，在药物未与靶受体结合之前即与药物结合，将药物转运出细胞外而造成耐药；另外，P-gp170还可通过改变细胞内环境、下调GC受体、抑制细胞凋亡、影响细胞因子发挥作用等多种功能而介导多种疾病的GC耐药。而目前国内外关于NS患儿P-gp170与GC耐药关系的研究非常有限，依据少数学者的有关研究，NS患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)P-gp170的表达与GC反应性有关；间接的实验证明甾体类固醇激素为P-gp170的底物之一，GC耐药NS患儿PBMC的P-gp170表达高于GC敏感者。但目前NS患者P-gp170介导GC耐药的确切机制及在肾组织的表达情况尚未可知。由于GC的效应主要由GC受体(GR)介导，GR在全身广泛存在，而肾组织也是GC作用的主要靶器官，因而我们推测NS患儿肾脏局部可能也存在P-gp170表达量的异常，而且这种异常可能与GC耐药有关。本研究首次通过检测NS患儿PBMC细胞内地塞米松(Dexamethasone，Dex)浓度与P-gp170表达量并分析二者的关系，以证实NS患儿PBMC胞内P-gp170表达与GC反应性有关，在此基础上，通过观察P-gp170在NS患儿肾组织中的分布、表达变化及其与临床GC疗效的关系，P-gp170表达与病理及临床指标的关系，进一步探讨其在NS患儿GC耐药机制中的作用。【目的】分析GC敏感和耐药NS患儿PBMC胞内Dex浓度变化与细胞膜表面P-gp170表达的相关性，并对有相关者做回归分析，以证实P-gp170可作为GC的药物转运泵在NS患儿GC耐药中发挥作用，并检测比较GC敏感和GC耐药NS患儿肾组织P-gp170mRNA及蛋白的表达，对两者进行肾组织P-gp170表达的差异、定位、与NS复发、病理类型的关系等临床及病理指标的分析，为探讨NS患儿P-gp170介导GC耐药临床的应用提供理论依据。【方法】选用24名初发未应用激素治疗的NS患儿为研究对象，根据随访资料显示将其分成激素敏感(SSNS)与激素耐药SRNS)组，10名健康体检儿童作为正常对照。以外周血单个核细胞为研究的靶细胞，，以Dex作用后，培养。分别在0h，12h，24h，36h收获细胞，每个时间点均设空白对照，以反向高效液相色谱法(reverse high performance liquid chromatography，R-HPLC)检测各组培养的不同时间点PBMCs细胞内Dex浓度变化；Wesrern blotting法检测培养的不同时间点PBMC细胞P-gp170的表达；选取96名NS患儿，分为初发未用激素者23例，正规应用半年内无复发者26例及应用一年有反复复发者47例，10名因外伤切除的肾组织为正常对照，微穿刺技术取得肾皮质组织后，常规染色后确定病理类型及计算病理积分；同时以免疫组织化学法检测肾组织P-gp170蛋白表达；原位杂交法检测P-gp170mRNA的表达；【结果】 1．NS患儿PBMC内Dex浓度随培养时间的不同而不同，培养时间愈长，细胞内Dex浓度愈高； 2．GC敏感患儿PBMC加入Dex前后PBMC的P-gp170表达具有显著性差异，加入Dex后细胞内Dex浓度渐增高，细胞膜P-gp170表达随培养时间的延长而渐降低；GC耐药患儿PBMC加入Dex前后细胞膜P-gp170表达无显著性差异，P＞0.05； 3．GC敏感NS患儿PBMC细胞内Dex浓度变化与细胞膜表面P-gp170活性呈显著负相关，回归分析示GC敏感患儿细胞内Dex浓度随P-gp170表达降低逐渐增高；而GC耐药患儿细胞内Dex浓度与P-gp170活性无显著相关； 4．免疫组织化学和原位杂交定位显示GC敏感与耐药NS患儿肾组织P-gp170均主要表达于肾小管，肾小球无表达；远端小管表达显著高于远端小管，P＜0.05，mRNA与蛋白的表达基本一致；GC敏感和GC耐药NS患儿肾组织P-gp170的表达具有显著性差异，GC耐药者P-gp170表达量显著高于GC敏感者，P＜0.05； 5．肾脏病理积分与肾组织P-gp170的表达有显著相关，病理积分较高者P-gp170表达阳性量高于病理积分低者，P＜0.05；不同病理类型P-gp170的表达有差异，局灶节段硬化型肾病(FSGS)、膜性肾病(MN)和硬化性肾病(SGN)表达较高，微小病变(MCD)和系膜增生型(MsPGN)者表达较低，P＜0.05； 6．6岁组患儿和6岁组患儿P-gp170的表达无差异，P＞0.05；复发者P-gp170的表达明显高于无复发者，P＜0.05；复发患儿肾组织P-gp170的表达与患儿的24小时尿蛋白定量(三次平均值)呈明显正相关，与尿蛋白转阴天数呈正相关，与首次复发与初发病的间隔的天数呈显著负相关；P-gp170的表达与GC应用总量、总疗程有呈显著相关。【结论】 1．健康儿童和NS患儿PBMC均有P-gp170的表达，NS状态下可有P-gp170表达增高，生理和病理状态下P-gp170的表达发挥的作用不完全一致； 2．PBMC膜P-gp170表达增高与NS患儿GC耐药有关，P-gp170表达增高介导了一部分NS患儿的GC耐药； 3．Dex为P-gp170的作用底物之一，P-gp170参与了Dex类GC药物PBMC膜胞内向胞外的转运； 4．应用GC可诱导NS患儿膜P-gp170的表达增高，一部分GC耐药者与GC应用所致P-gp170增高，导致GC耐药； 5．NS患儿PBMCP-gp170的表达增高为GC耐药标志之一。 6．P-gp170在正常人肾脏组织中即有一定量的表达，表达部位主要见于肾小管细胞膜； 7．P-gp170在NS患儿肾组织的表达与肾病病损有关，可结合病理类型和病理损伤程度同时检测肾组织P-gp170来预测不同患儿GC反应性； 8．P-gp170的肾组织的表达与GC的用量有关，部分NS患儿耐药机制由GC应用至一定量导致P-gp170的表达增高有关； 9．P-gp170肾组织的表达增高与NS活动和复发有关，可作为临床预测预后的指标。
【图文】：

患儿,折光度,细胞

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患儿,折光度,细胞

3，severity的细胞，细胞折光度好，无污染，均习图10小时GC敏感患儿PBMCs(400倍)，胞折光度好，无污染，均>10‘个/mLigure1PBMCsofSSNSatoh(400timesooddiopterandnopollution，>106/毗
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R726.9

【参考文献】