Abp1及IL-17A活化ROS-NLRP3-caspase-1轴分别介导足细胞损伤的机制研究

发布时间：2020-05-25 23:45

【摘要】：第一部分Abp1在调控足细胞功能中的作用及机制初探第一节Abp1在足细胞中的表达及功能目的:探讨Abp1是否在肾脏组织及足细胞中有表达,及Abp1对足细胞功能的影响。方法:通过RT-PCR及免疫荧光检测Abp1在肾脏组织及足细胞的表达;免疫荧光检测Abp1与F-actin的空间位置关系;构建Abp1过表达慢病毒质粒载体,转染慢病毒,获得Abp1过表达细胞株,并用Q-PCR及western blot检测Abp1的m RNA及蛋白水平变化;CCK8检测过表达Abp1增殖活性;流式细胞术检测足细胞凋亡;结晶紫染色检测足细胞粘附功能;Q-PCR检测足细胞podocin及nephrin的m RNA表达。结果:肾脏组织及足细胞特异性表达Abp1,Abp1分布于足细胞胞浆,与F-actin有共定。与对照组比较,Abp1过表达组的Abp1的m RNA及蛋白水平明显增加(P0.05);与对照组相比,过表达组的增殖活性降低,凋亡增加,粘附功能降低,F-actin骨架结构破坏(P均0.05);与对照组相比,Abp1过表达、podocin及nephrin的m RNA表达水平间无统计学意义(P0.05)。结论:Abp1在肾脏局部及足细胞有表达,过表达Abp1对足细胞的增殖、凋亡及粘附功能有影响。第二节Abp1调控足细胞功能的机制研究目的:初步探讨Abp1调控细胞形态、增殖、凋亡的潜在机制。方法:流式细胞术检测足细胞周期,Q-PCR检测细胞周期相关蛋白cyclin D1、P27等蛋白变化;Q-PCR检测YAP及dendrin的表达;western blot及pull down检测Rho A表达及活性;免疫荧光检测Abp1与Arp2/3、N-wasp在足细胞的空间位置关系;鬼笔环肽染色检测足细胞骨架结构F-actin;Q-PCR及western blot检测LPS诱导的足细胞损伤模型中Abp1、Rho A、YAP、dendrin等蛋白的表达。结果:与正常组相比,Abp1过表达组细胞周期停滞在S期,细胞周期蛋白cyclin D1表达降低,P27表达上调(P均0.05);与正常对照组相比,过表达Abp1可使YAP表达降低,dendrin表达增加,Rho A表达减少,活性降低,且足细胞骨架结构F-actin破坏(P均0.05);Abp1与Arp2/3、Abp1与N-wasp共定位足细胞胞浆;与正常对照组相比,LPS组Abp1表达增加,Rho A表达下降,活性降低,且YAP表达降低,dendrin表达增加(P均0.05)。结论:Abp1可能通过调节cyclin D1及P 27的表达,使足细胞周期停滞在S期,抑制细胞增殖;Abp1可能通过调控Rho A-YAP-dendrin促进细胞凋亡;Abp1可能通过调控N-wasp/Arp2/3复合体影响足细胞足突结构;LPS可能通过上调Abp1表达抑制Rho A酶活性,促进足细胞凋亡。第二部分IL-17A活化ROS-NLRP3-caspase-1轴介导足细胞损伤的机制研究目的:体外IL-17A刺激干预足细胞,探讨IL-17A诱导足细胞损伤的潜在机制。方法:细胞分为5组,正常对照组,IL-17A组,IL-17RA组,NAC组及YVAD组。Q-PCR及western blot检测足细胞NLRP3、caspase-1、podocin及desmin的表达,流式细胞术检测细胞内ROS水平,比色法检测caspase-1活性,ELISA检测足细胞分泌IL-1β的分泌水平变化,鬼笔环肽染色细胞骨架F-actin。结果:与对照组相比,IL-17A组NLRP3、caspase-1的表达增加,且呈现时间剂量依赖性,caspase-1活性及IL-1β分泌水平增加,胞内ROS水平增加,desmin表达增加,podocin表达下降,F-actin骨架结构破坏(P0.05)。与IL-17A组相比,IL-17RA组胞内ROS水平降低,NLRP3及caspase-1基因表达下降(P0.05)。与IL-17A相比,NAC组胞内ROS水平降低,caspase-1活性及IL-1β分泌水平降低,desmin表达降低,podocin表达增加,F-actin骨架纤维丝增加(P0.05)。与IL-17A组相比,YVAD组caspase-1活性及IL-1β分泌水平降低,desmin表达降低,podocin表达增加,F-actin骨架纤维丝增加(P0.05)。结论:IL-17A可以通过活化ROS-NLRP3-caspase-1轴诱导足细胞分泌IL-1β从而介导足细胞损伤。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R726.9

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本文编号：2680926