高氧致CLD早产鼠肺细胞凋亡、增殖和间质纤维化的动态变化及其机制研究

发布时间：2020-05-28 19:16

【摘要】： 前言低氧血症是合并心肺疾病早产儿最常见的临床表现，也是导致中枢神经系统不可逆性损害的重要原因之一，因此，临床医生对早产儿低氧血症均能给予高度警惕和足够重视。然而恰恰忽视了氧毕竟属于气体药物，若长时间吸入高浓度氧仍可导致不同程度的肺组织损伤，重者可发生早产儿慢性肺疾病(chronic lung disease，CLD)。虽高吸气压力的机械通气及感染也可导致早产儿CLD，但目前高浓度氧仍被认为是CLD发生的最危险因素及最主要原因。近年来，随着极低体重儿抢救存活率的提高，其发病率国外已达30％～40％，而我国也呈逐年上升趋势。因其发病机制尚不清楚，故目前仍无有效的监控手段及防治措施。以往一直认为肺间质纤维化是CLD的主要病理变化，而近年来国内外学者均注意到肺发育障碍已成为影响CLD预后及早产儿日后生活质量的重要因素，故提出肺发育停滞是CLD的新特征。因此，研究高氧致早产儿CLD发生中肺形态学动态演变规律，探索其发病机制已成为当今新生儿领域亟待解决并最具挑战性的研究课题之一。目前有关CLD发生机制的研究多集中于：1)因早产儿体内抗氧化系统尚未发育成熟，吸入高浓度氧后，大量的氧自由基及活性氧生成，使肺内氧化／抗氧化系统失衡，从而导致氧化应激性肺损伤；2)病程初期大量炎性细胞(主要是肺泡巨噬细胞)在肺内潴留，激活并持续释放IL-6、IL-8及TNF-α等前炎症因子，使中性粒细胞从血管腔迁移、聚集到肺组织，通过释放氧自由基、蛋白水解酶等而引发肺部的炎症反应。上述研究侧重阐明了高氧诱导肺损伤的发生机制，而有关细胞凋亡是否参与CLD的发生过程?高氧是抑制还是诱导肺细胞的增殖效应?目前结论各异。而关于Ⅱ型肺泡上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell，AEC-Ⅱ)在CLD肺上皮重塑中作用如何?肺组织纤维增生的机制等诸多问题，目前研究甚少。本研究以高氧致早产鼠CLD模型为对象，应用分子生物学等检测技术，观察肺形态的动态演变过程；研究肺细胞的凋亡及其发生机制；探索肺细胞增殖的动态效应及其细胞周期的调控机制;并试图阐明CLD肺间质纤维化的发生机制。从而为完善早产儿CLD的发生机制及寻求有效的防治途径奠定实验基础。材料与方法一、动物模型实验组将早产的SD大鼠(连同代母鼠)生后即置于氧箱中，持续输人氧气，维持Fio:为0.90(美国oM一SME型测氧仪监测)，用钠石灰吸收 CO:，使其浓度0.5%(Dapex气体分析仪)，温度22℃一25℃，湿度50%- 70%，每天定时开箱0.sh，添加水、饲料及更换垫料，并与对照组交换母鼠以避免因氧中毒而致喂养能力下降。对照组FIO:为0.21(即空气)，具体方法及实验控制因素同实验组。二、实验标本采集及处理分别于实验后的ld、3d、7d、14d和21d随机处死后分离肺组织。用于肺形态学观察、免疫组织化学、原位杂交及脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)检测的标本置于4%多聚甲醛中固定;用于超微结构观察的标本置于2.5%戊二醛中固定;用于酶联免疫吸附法(en- zyme linked immunoadsothent，ELISA)和反转录聚合酶链反应(reverse tran- seription polymerase ehain reaetion，RT一PCR)检测的标本置于Eppendorf管中，，于一0℃冰箱中冻存。三、实验方法及检测指标 1.肺形态的研究 l)光镜下观察:①观察肺组织的病理变化;②放射状肺泡计数(radic公滋vealar counts，RAC);③肺泡面积/肺间隔面积(灯s)(美国Universal Ima- gingPo印oration图像分析系统)④观察肺组织内的胶原沉积(vG染色)。 2)透射电镜下:观察AEC一11表面微绒毛(Mv)、细胞质内线粒体(Mi) 及板层小体(LB)变化。 2.肺细胞凋亡及其机制研究 1) TUNEL技术:观察肺细胞凋亡指数(apoptosis index，AI)。 2)免疫组织化学技术(SABC法):测定肺组织Bax及Bcl一基因蛋白表达。 3)RT一PCR技术:测定肺组织Caspase一mRNA表达。 3.肺细胞增殖及其机制的研究 l)免疫组织化学技术(SABC法):观察增殖性细胞核抗原(proliferating eell nuelear anu罗n，pCNA)指数。 2)原位杂交技术:测定肺组织细胞周期蛋白依赖激酶一(cyclin depend- entk访ase，CDKZ)CDKZ InRNA表达。 3)RT·PCR技术:一测定肺组织肺表面活性蛋白A、B( plumon田叹SUlfactant protein，SP一A、SP‘B)及水通道蛋白一(Aquapo血，AQP-5)基因表达。 4.肺间质纤维化发生机制的研究 1) EllSA方法:测定肺组织I型胶原、纤维连接蛋白(fibronectin，FN) 及透明质酸(场公uronicac记，HA)含量。 2)免疫组织化学技术(SABC法):测定肺组织转化生长因子p，(trans- fo耐nggro袖faetor一p:，TGF一p:)蛋白表达。 3)RT一PCR技术:测定肺组织TGF一p:、基质金属蛋白酶名(matrix met沮- loproteinases，MMp名)及其组织抑制因子一l(tissue inhibitor of metalloprotein- ase。，nMp一l)基因表达。四、统计学分析应用SPSS ro.o统计软件进行统计学处理，所有数据均以又士s表示，组间比较采用Dunnettt检验，相关
【图文】：

肺组织,二基,蛋白表达,血浆

对级组21d肺组织Bate基因蛋白表达(免狡组化x4加)
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R722.6

【参考文献】