AQP1及α-ENaC基因及蛋白在高氧致肺损伤新生鼠中动态变化

发布时间：2020-06-01 01:48

【摘要】： 前言随着机械通气的广泛开展,早产儿管理技术的日益提高和肺表面活性物质的普遍应用,早产儿,尤其是极低出生体重儿的存活率有了明显提高,随着而来因长时间吸入高浓度氧所导致的早产儿慢性肺疾病(chronic lung disease,CLD)的发生率亦在增加,严重影响了早产儿的生存质量,是目前导致新生儿致残主要疾病之一。尽管高氧致CLD的发生机制还不清楚,但有关其病理过程及病理变化已基本明确,即早期的肺水肿及晚期肺间质纤维化,目前的多数研究试图从拮抗肺纤维化的角度来达到目的,但效果并不理想。那么若能从CLD早期阶段—肺水肿期为突破点,探索其发生的可能机制,从而为CLD新的防治途径的设计奠定实验和理论基础。高氧肺损伤是一组织弥漫性肺泡炎和损伤后的修复重建的复杂病理、生理过程,其肺损伤早期特征性改变是肺水肿。目前认为CLD早期肺水肿的发生多与炎症因子异常表达有关,但应用其拮抗剂后其肺水肿程度无明显减轻。氧化应激反应也被认为与肺水肿有关,但应用抗氧化剂治疗和预防,疗效也不显著。水通道蛋白(Aquaporin, AQP)是新近发现与水通透性有关的细胞膜转运蛋白,目前认为与肺组织密切的有AQP1、AQP3、AQP4、AQP5。胎儿肺组织AQP1表达呈缓慢上升,而临近预产期时显著增加,生后初期随日龄呈时向性变化,提示生后初期AQP1与肺内液体快速转运密切相关。钠通道蛋白(Epithelium sodium channel, ENaC)是一种跨膜蛋白,是肺内液体转运的重要通道,由αβγ三个同源亚基组成,早产儿气道上皮ENaC表达明显低于足月儿,其低水平的表达与呼吸窘迫发生密切相关本研究采用高氧致肺损伤新生鼠模型为对象,通过测定肺组织AQP1、a-ENaC的表达基因及蛋白表达,试图阐明AQP1、a-ENaC在高氧肺损伤发生、发展中的动态表达规律。材料与方法一、动物实验 (一)实验分组及动物模型的制备 1、研究对象健康Wistar大鼠雌雄各40只,雌雄交配(4：1),孕22-23d自然分娩的新生鼠80只,生后12小时内(0d),依据吸氧浓度Fi02随机分组。 2、动物模型建立：采用以往所建立的研究方法将新生Wistar大鼠80只依据吸氧浓度分为随机二组：实验组(Fi020.90)和对照组(Fi020.21),每组均为40只；实验组：生后即置于氧箱中,持续输入氧气,维持Fi02为0.90(用测氧仪监测),C02浓度0.5%(用钠时会吸收C02),温度25～27℃,湿度50%70%。每天定时开箱0.5小时,添水、饲料及更换垫料,并与空气对照组交换母鼠以避免因氧中毒而致喂养能力下降。对照组：Fi02为0.21,放置与模型组同一室内空气饲养,具体方法及实验控制因素同实验组。 (二)实验标本的收集、方法于实验后24h、48h、72h 5、7天分别从两组随机抽取8只,用10%水合氯醛麻醉后立即打开胸腔,分离肺组织。将左肺置于4%的多聚甲醛中固定,石蜡包埋,常规制备5um切片,苏木素-伊红染色后用于肺形态学观察。右肺组织置于无Rnase的Eppendorf管中,-80℃保存,用于免疫组化、免疫荧光、RT-PCR检测。二、实验方法及检测指标 (一)肺组织形态学观察光镜下观察肺组织形态改变,观察高氧致新生鼠CLD肺的病理学改变。 (二)免疫组织化学技术检测肺组织AQP1蛋白表达,免疫荧光检测肺组织α-ENaC蛋白表达于每个时间点抽取染色清晰的切片10张,每张切片于光镜下(×400)随机抽取5个视野,固定窗口面积,以胞浆中只有棕黄色颗粒为阳性细胞,其蛋白定量利用美国的Universai Imagining Porppration图像分析系统,应用Meta Morph软件测定平均积分光密度值,用来表示肺组织AQP1蛋白表达强度。每个时间点抽取染色清晰的切片10张,每张切片于光镜下(×400)随机抽取5个视野,固定窗口,于暗室中发翠绿色荧光为阳性表达,依据表达强弱来表示α-ENaC蛋白表达的强度。 (三)Real-time PCR检测肺组织AQP1、α-ENaC mRNA的表达先构建目的基因(AQP1基因和a-ENaC基因)和管家基因(GAPDH)的RNA标准品,制作标准曲线,利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正,检测各组细胞中AQP1及a-ENaC目的基因的相对表达量。AQP1 mRNA的相对表达量=AQP1基因拷贝数／GAPDH基因拷贝数。α-ENaC mRNA的相对表达量=a-ENaC基因拷贝数／GAPDH基因拷贝数,校正结果以生理盐水对照组为1,其余组与之相比较。三统计学分析所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS14.0对各组间数据进行分析,两样本方差齐性检验采用F检验,根据样本的方差齐性检验F值,两组间比较用t检验或t'检验,多组间比较采用ANOVA分析,以P0.05表示统计学有显著意义。结果一、肺组织形态学改变对照组大鼠1-3天肺组织水肿,肺泡腔内大量渗液,间质水肿,小血管扩张充血,5-7天支气管、肺泡结构趋于正常,肺结构完整,肺泡间隔均匀一致,壁光滑,无渗出液,无出血及灶性肺水肿；高氧1-2天与对照组无明显差别；高氧暴露3天与对照组比较,见肺泡上皮细胞肿胀,肺泡腔内大量渗液,小血管扩张充血,间质水肿,炎性细胞明显增多,但肺泡结构尚完整；高氧5、7天时上述改变进一步加重,肺泡壁增厚,肺组织结构紊乱。二、肺组织免疫组织化学技术检测肺组织AQP1蛋白表达实验开始后,第24h、48h实验组与对照组肺组织AQP1蛋白表达强度无明显差异(P0.05)。第3天AQP1蛋白表达明显低于对照组(P0.05),高氧第5、7天实验组AQP1蛋白表达减弱更明显。(P0.01) 三、肺组织免疫荧光检测α-ENaC蛋白表达实验后,第24H、48ha-ENaC蛋白表达强度无明显差异,第3、5、7天实验组有明显减弱。四、RT-PCR技术检测肺组织AQP1mRNA、α-ENaCmRNA表达实验开始后24h、48h天,实验组和对照组肺组织AQP1mRNA、α-ENaCmRNA基因表达强度无显著差异(P0.05)；AQP1基因表达与对照组相比于高氧后第3、5、7天减弱更加明显(P0.05)。a-ENaC基因表达与对照组相比,第3天下降,第5、7天表达明显减弱(P0.05)。结论 1、高氧暴露后第3天AQP1蛋白及基因表达下降,第3、5、7天下降更明显,该基因蛋白表达变化与高氧3-7天出现肺水肿呈现同一时相变化。推测此时AQP1的表达下降,可能与肺水肿有关。 2、高氧暴露后α-ENaCmRNA表达逐渐下降,第5、7天下降明显,也可能与肺水肿的出现有关。
【图文】：

肺组织,新生大鼠,HE染色,实验组

新生大鼠肺组织HE染色(X200)A对照组1天肺组织，B实验组1天与肺组织无明显差异，C对照组3天肺组织表现，，D实验组3天肺组织表现，E对照组7天肺组织表现，F实验组7天肺组织表现为充血水肿，渗出明显.

新生大鼠,免疫组化,对照组,实验组

新生大鼠组织AQPI免疫组化(X400)A对照组ldAQPI有表达，B实验组ld与对照组无明显差异。C对照组3dAQPI表达明显，D实验组3d较对照组表达减少。E对照组7dAQPI表达明显，F实验组7d较对照组表达减少。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R722.1

【参考文献】