同型半胱氨酸所致大鼠仔鼠先天性心脏病与PAX-8基因表达的研究

发布时间：2020-06-09 13:21

【摘要】： 目的:通过同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)干预孕鼠,建立大鼠仔鼠先天性心脏畸形模型,探讨Hcy与先天性心脏病(congenitalheart defect,CHD)PAX-8基因表达的关系及叶酸(Folic Acid,FA)、VitB_(12)对Hcy的干预作用,从心脏发育的分子学角度探讨CHD发生的病因。 方法:40只S-D孕鼠随机分为四组:高剂量Hcy建模组(A组)、低剂量Hcy建模组(B组)、高剂量Hcy+(FA+VitB_(12))干预组(C组)及对照组(D组),每组各10只孕鼠。大鼠自妊娠第7天开始腹腔内注射不同剂量的Hcy:A组2%Hcy 2mg/10g/d、B组1%Hcy1mg/10g/d、C组2%Hcy 2mg/10g/d、D组注射生理盐水0.1ml/10g/d,C组自确定妊娠起,按FA 0.05mg/10g/d+VitB_(12) 1mg/10g%qd给药,至孕鼠自然分娩时停药。每日观察孕鼠,待其自然分娩当日,体视显微镜下解剖仔鼠,观察仔鼠心脏畸形情况。选取A、B、C三组内VSD仔鼠心脏各5例,非CHD仔鼠心脏各15例,D组非CHD仔鼠心脏15例,提取RNA,应用real time PCR检测PAX-8 mRNA在仔鼠心脏的表达情况;同时选取A、B、C三组VSD仔鼠心脏各2例、非CHD仔鼠心脏各5例、D组非CHD仔鼠心脏5例,5%甲醛固定,石蜡包埋,应用免疫组化检测PAX-8蛋白在仔鼠心脏的表达情况。 结果:1、A、B、C、D四组平均产仔数分别为:9.04只、12.1只、11.56只及13.56只,A、B、C三组平均产仔数分别与D组比较,p值均＜0.01;A、B、C三组平均产仔数之间两两比较,p值均＜0.01,提示外源性Hcy可导致孕鼠产仔数减少,通过对孕鼠用FA+Vit B_(12)干预,可增加孕鼠产仔数。 2、A、B、C、D四组仔鼠心脏畸形率分别为:13.5%、9.17%、8.77%及0.74%,A、B、C三组之间两两比较,p值均＞0.05;A、B、C三组分别与D组比较,p值均＜0.01,提示外源性Hcy可引起仔鼠心脏畸形。 3、PAX-8 mRNA在A、B、C、D四组组内及组间仔鼠心脏表达的比较:PAX-8 mRNA在VSD仔鼠心脏细胞中的表达均低于非CHD仔鼠,p值均＜0.01。A、B、C三组VSD仔鼠心脏细胞中的PAX-8mRNA表达比较:B组＞A组,A组＞C组,p值均＜0.01,B组与C组比较p＞0.05。A、B、C、D四组非CHD仔鼠心脏组织中的PAX-8mRNA表达比较,p值均＞0.05。VSD仔鼠心肌组织PAX-8 mRNA表达水平与孕鼠Hcy注射剂量呈负相关,r=-0.949,p＜0.01。 4、PAX-8蛋白在A、B、C、D四组组内及组间VSD仔鼠心脏细胞中表达均低于非CHD仔鼠,p值均＜0.01。PAX-8蛋白在A、B、C三组VSD仔鼠之间心脏中的表达比较无差异,p值均＞0.05。四组非CHD仔鼠心脏细胞中的表达比较无差异,p值均＞0.05。 结论:1、PAX-8mRNA在VSD胎鼠心肌中的呈低表达,且与Hcy剂量呈负相关,PAX-8基因的低表达可能与VSD的形成有关。 2、高水平的Hcy具有胚胎毒性,孕期FA与VitB_(12)干预可增加平均胎产数,降低Hcy的胚胎毒性。
【图文】：

取PCR扩增产物1川，2%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA逆转录的结果，应用凝胶成像系统检测分析有无目的基因PAX一8基因及管家基因GAPDH的扩增从而判断cDNA合成的质量并判断口的片段的大小。见图2一3，与 DNAMarker比照，各片段的PCR反应产物的长度与所设计的各片段大小预期值符合，特异性较理想，可进行实时荧光定量PCR。电泳条件:电压10OV;时间30min。图2一 3PAX一8基因及GAPDH扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳图。其中PAX一8基因片段大小为 174bp，GApDH片段大小为，140bp.

学位论文第二章材料与方法设定每个循环的变性期结束后，程序自动记录上一个循环最后10%时间的平光值，以表示上一个循环结束时的PCR产物的量。反应完成后，得到标本线，软件将自动进行数据分析，调整基线，计算出Thresholdcycle(Ct值)反应均以ddHZO代替模板作为阴性对照，实验重复三次以上。①PAX一8及GAPDH荧光定量PCR的动力学曲线PCR仪检测荧光强度的时相统一设定于扩增反应的退火期，本实验采用作为退火期。40个循环的扩增反应结束后，系统将对采集到的每一循环反的各反应管中的的荧光强度增长指数(D孙)进行分析，绘制每一反应管的动力学曲线(见图2一4)。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R725.4

【参考文献】

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本文编号：2704748