【摘要】：研究背景人体肠道的正常菌群在促进食物消化、合成蛋白质和维生素等营养物质、抵御外来致病菌侵入以及增强机体免疫能力等方面有着重要作用。并且,多种疾病状态可改变肠道菌群的结构及数量,导致肠道菌群紊乱,从而诱发疾病的发生。近年来,人类微生物组已被证实与多种疾病的发病和进展有关,包括溃疡性结肠炎[1]、哮喘[2]、特应性皮炎[3]等。随着脑-肠-微生物轴[4]的提出,多种神经系统及其相关疾病如多发性硬化[5]、自闭症[6]等也被证实收到肠道微生物的调控作用。过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura,HSP)是一种自身免疫性疾病,可发生全身小血管的免疫炎性改变。发病原因和机制尚不明确,目前认为与机体的免疫炎症反应有关。临床表现主要包括皮肤小血管炎即紫癜,关节病变如关节肿痛,消化道病变如腹痛、消化道出血,以及肾脏病变,可呈现为肾炎或肾病改变。其中,累及肾脏的HSP病程迁延,可持续数月或数年,且长期或反复使用类固醇和免疫抑制剂可引起一系列并发症,影响生活质量。而累及消化道的腹型HSP可在急性期出现较严重的临床症状如消化道出血等,且非典型患儿容易误诊[7]][8]。辅助检查无特异性诊断试验,也导致非典型病例的诊断困难。因此,研究和分析其临床特征和免疫学特征对于该疾病的早期诊断是具有重大意义的。同时,作为儿科常见的自身免疫性疾病之一,HSP的发病和进展是否也受到肠道菌群的调控是值得思考的。宏基因组程序的发展使得肠道与其微生物菌群之间能够进行复杂的交互。16S rDNA可以做作为揭示生物物种的特征核酸序列,是目前研究细菌系统发育和分类鉴定应用最多和最合适的指标[9],是研究微生物构成的重要手段[10]。16S rRNA共包括19个区域,分为高变区域和保守区域。高变区域具有种属特异性,而保守区域则不然。因此,16S rDNA扩增子测序通常是利用保守区设计通用引物对某个或某几个变异区域进行PCR扩增,然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定。在Illumina MiSeq测序平台的基础上扩增16S区域,并根据这些区域的特点,对物种进行注释,并进行丰度分析,从而明确构成样品的物种;通过多样性分析等信息分析可进一步的发现样品之间的差别。因此,可利用16S rDNA扩增子测序的方法来分析HSP儿童和健康儿童的肠道菌群并进行比较。同时,通过比较和分析不同临床类型和不同病情程度HSP患儿肠道菌群的差异,可为该疾病的治疗和预后估计提供一定方向。研究分为三个部分:一、不同临床类型的过敏性紫癜儿童免疫学特征的比较和分析目的明确不同年龄组HSP儿童明确不同年龄组过敏性紫癜儿童临床及免疫学特征的差异及其与器官累及的相关性。方法收集我院首诊并住院治疗的过敏性紫癜患儿共236例,于我院健康体检儿童200例。根据年龄分为≤6岁组和6岁组;根据临床症状和器官累及分为皮肤组、关节组、胃肠道组、肾脏组和混合组。对其进行外周血淋巴细胞亚群分析、免疫球蛋白和补体测定、中期因子和炎症细胞因子测定以及维生素D水平测定并进行比较分析。结果关节症状更易出现在≤6岁组中的较大年龄患儿,腹痛、血尿、蛋白尿更多见于6岁组中的较大年龄患儿。6岁组患儿更易累及消化道和肾脏,累及器官数目各年龄组无差别。腹型HSP患儿血清IgA、IgG水平明显升高;肾型患儿血清IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ水平明显升高,CD3+和CD3+CD4+比例降低。血清MK水平在HSP患儿尤其累及肾脏者明显升高,且与IL-4、IL-6、IL-17呈正相关。血清25-(OH)D3水平较低的HSP患儿更容易发生肾脏损害,且激素使用率和住院日均明显增加。结论HSP患儿中高水平的IgA、IgG与消化道累及有关,而IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ水平升高和CD3+、CD3+CD4+比例降低与肾脏累及相关;血清MK和维生素D可作为早期诊断HSP和预测肾损害的有效指标。二、不同临床类型的过敏性紫癜儿童肠道菌群的比较和分析目的明确肠道菌群的构成与HSP患儿的器官累及有无相关性。方法将收集的病例分为以下3组:单纯皮肤型患儿即GZ1组,无消化道表现的混合型即GZ2组,有消化道表现的混合型即GZ3组,健康儿童对照组即CON组。将各组儿童的粪便样品收集并冻存,进行基因组DNA的提取、PCR扩增、PCR产物的混样和纯化、文库构建和上机测序,将测序数据处理后从OTUs分析、物种注释、样品复杂度分析、多样品比较等方面进行信息分析。同时采集各组儿童的外周血进行淋巴细胞亚群分析、免疫球蛋白和补体测定、中期因子和炎症细胞因子测定以及维生素D水平测定并进行比较分析。结果 GZ1、GZ2、GZ3组的物种构成序列数目较CON组低,以GZ2、GZ3组为著。在所有样本中检测到超过10个细菌门,四种丰度最高的细菌门是拟杆菌、厚壁菌、变形杆菌和放线菌。GZ2和GZ3组中变形杆菌的相对丰度明显高于GZ1和CON组,而放线菌的相对丰度则有显著降低,且GZ1组中放线菌的相对丰度低于CON组。UPGMA聚类树和各组样本的主成分分析显示,同组样本的微生物群落组成是相似的,同时与其他组别样本的细菌门组成有明显差别。Chaol指数曲线反映了微生物的丰富度和生物多样性。稀释曲线和Shannon曲线中多数样品的曲线趋于变平坦,这表明样品中的大多数细菌物种都被检测到,反映了测序数据量的合理性。GZ3组血清IgA、IgG水平较CON组明显升高,GZ2组的IgG水平也明显升高;GZ2、GZ3组血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ、MK水平明显高于CON组,而CD3+比例和25-(OH)D3水平较CON组明显降低。结论HSP儿童肠道微生物的丰度较正常儿童低,且在混合型HSP患儿中更为明显。拟杆菌,厚壁菌,变形杆菌和放线菌为儿童肠道菌群中相对丰度最高的4种细菌门。变形杆菌和放线菌与HSP的免疫炎症反应和器官累及有关。三、不同病变程度的腹型过敏性紫癜儿童肠道菌群的比较和分析目的 明确肠道菌群的构成与腹型HSP患儿的病情程度有无相关性。方法 将收集的病例分为以下3组:无消化道出血的腹型HSP患儿组即HSP-A组,有消化道出血的腹型HSP患儿组即HSP-B组,健康儿童对照组即CON组。标本收集、实验方法同第二部分。结果 HSP-A和HSP-B组的Tags和OTUs数目均低于CON组。HSP-A和HSP-B组各分类水平上的序列数目均低于CON组,且HSP-B组的序列数目明显低于HSP-A组。所有样品中超过98.0%的序列属于4种丰度最高的细菌门,即拟杆菌、厚壁菌、变形杆菌和放线菌。HSP-B组中的拟杆菌丰度较CON组明显增高,而其厚壁菌丰度比CON组降低;HSP-A、HSP-B组的变形杆菌丰度明显高于CON组,放线菌丰度明显低于CON组;HSP-B组中放线菌的相对丰度较HSP-A组降低。各组样本肠道菌群的聚类分析和主成分分析显示同组样本间的肠道菌群具有较高的相似性。大多数样品稀释曲线趋于变平坦,表明样品中的大多数细菌物种都被检测到,反映了测序数据量的合理性。两组HSP患儿的血清IgA、IgG水平较CON组升高,在HSP-B组中更明显;HSP-B组IgE水平较CON组也有明显升高;两组HSP患儿CD3+比例较CON组明显降低,HSP-B组CD3+CD4+比例明显低于CON组;两组HSP患儿血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF、IFN-γ、MK水平均明显高于CON组,其中HSP-B组IL-4、IL-17水平明显高于HSP-A组;血清25-(OH)D3水平在HSP-A、HSP-B组患儿中明显低于CON组。结论腹型HSP患儿肠道微生物的丰度较正常儿童低,且病变程度越重,该差别越明显。拟杆菌,厚壁菌,变形杆菌和放线菌为儿童肠道菌群中相对丰度最高的四种细菌门。放线菌与HSP的免疫炎症反应和其消化道病变的程度有关。综上所述,本研究结论如下:1.HSP患儿中高水平的IgA、IgG与消化道累及有关,IgG、IgM、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-y水平升高和 CD3+、CD3+CD4+比例降低与肾脏累及相关。2.血清MK和维生素D可作为早期诊断HSP和预测肾损害的有效指标。3.HSP儿童肠道微生物的丰度较正常儿童降低,且在混合型HSP患儿和病情较重的患儿中尤为明显。4.拟杆菌,厚壁菌,变形杆菌和放线菌为儿童肠道菌群中最丰富的4种细菌门,变形杆菌和放线菌与HSP的免疫炎症反应和器官受累有关,且放线菌与HSP消化道病变的程度有关。
【图文】：
图２肠道微生物细菌门相对丰度的比较逡逑注：横坐标是样品名称；纵坐标表示相对丰度，，？直方图自上而下的颜色代表相逡逑对丰度最氋的前１０位的细菌门相对丰度的总和
图３－１：四组儿童肠道菌群中厚壁菌的相对丰度（％）逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R725.5
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