AMPA受体拮抗剂对新生鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

发布时间：2020-06-10 17:37

【摘要】：目的:新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是造成新生儿死亡和儿童永久性神经功能障碍的常见原因。其发病机制尚不完全清楚,因此缺乏有效的防治手段。近年研究表明AMPA谷氨酸受体在HIBD发生发展过程中起重要作用。本实验采用新生鼠HIBD模型,应用选择性非竞争性AMPA受体拮抗剂GYKI52466进行干预,观察海马CA1区神经元数、脑白质髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)、神经丝(neurofilament,NF)蛋白表达变化,了解治疗对脑中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、还原型谷光甘肽(reduced glutathione,GSH)及细胞凋亡的影响,通过测试实验动物学习记忆功能认识治疗的远期效果,初步探讨GYKI-52466在新生鼠HIBD中的保护作用及机制,为临床防治新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy HIE)寻求新的途径。方法:7日龄(postnatal day 7,P7)Wistar大鼠,采用Rice法建立新生鼠HIBD模型,随机分成正常对照组、假手术组、缺氧缺血组及 GYKI-52466干预组。正常对照组用于观察MBP、NF在正常新生鼠的表达情况,其余三组于缺氧缺血(hypoxia-ischemia,HI)后24小时(24h)、1周(1w)取脑,HE染色观察组织病理改变,计数海马CA1区神经元数;免疫组化、图像分析法测双侧脑半球横截面积之比,检测脑组织MBP、NF表达及积分光密度值;生化法检测各组大鼠脑组织MDA、SOD、GSH水平;TUNEL法检测脑组织细胞凋亡;于P30用 Morris水迷宫测试大鼠学习记忆功能。结果:(1) HI后患侧脑组织横截面积下降。HI后1w,缺氧缺血组患侧与对侧脑半球横截面积之比(L:RAREA)较假手术组明显降低(p0.001);GYKI-52466干预组L:R AREA值明显高于缺氧缺血组(p0.001)。(2) MBP在P8无显著表达。P11嗅束、纹状体、胼胝体、内囊、外囊染色阳性,可见少许突起延伸至皮层。P14上诉部位表达更加丰富,前联合出现染色阳性。NF-H表达部位与MBP相似,但表达量较少。HI后1w,缺氧缺血组患侧与对侧脑组织MBP积分光密度之比(左侧:右侧,L:RMBP)明 WP=9 显低于假手术组(p0.02),干预组L:RMBP高于缺氧缺血组(p0.05)。HI后及治疗后NF-H表达变化趋势与MBP相似。(3) HI后1w,缺氧缺血组CA1区神经元数显著降低(p0.001),干预组CA1区神经元数较缺氧缺血组明显增多(p0.001)。(4) 假手术组新生鼠脑中偶见TUNEL阳性细胞,缺氧缺血组TUNEL阳性细胞数显著增多,GYKI-52466干预使得TUNEL阳性细胞数明显减少(p0.01);(5) HI后24h检测,缺氧缺血组SOD活力、GSH含量明显低于假手术组(p0.001,p0.001),MDA含量明显高于假手术组(p0.001)。GYKI-52466干预组脑组织SOD活力、GSH含量明显高于缺氧缺血组(p0.001,p0.005),MDA含量明显低于缺氧缺血组(p0.001)。(6) 生后30天,缺氧缺血组大鼠的学习、记忆功能严重受损,Morris水迷宫实验逃避潜伏期(EL)较假手术组延长,撤除平台后90秒内跨越平台次数减少(p0.001);而与缺氧缺血组相比GYKI-52466干预组大鼠的学习、记忆功能障碍明显减轻,逃避潜伏期缩短,跨越平台次数增加(p0.01)。结论: 1. 7日龄Wistar大鼠,结扎一侧颈总动脉后予低氧(8%O2)2.5小时,制成HIBD模型,患侧脑组织可见梗死灶及萎缩现象,神经细胞坏死、凋亡,模型成功可行。 2. HIBD新生鼠患侧脑组织MBP、NF-H表达下降,CA1区神经元数减少,反映不仅新生鼠脑灰质对缺氧缺血敏感,脑白质同样对缺氧缺血损害存在敏感性。 3. GYKI-52466能减少神经元损伤,减轻HIBD大鼠患侧脑组织MBP、NF-H表达下降程度,说明腹腔注射GYKI-52466不仅对HIBD的神经元损害具有保护作用,也能保护少突胶质细胞和轴突。 4. GYKI-52466治疗提高患侧脑组织SOD、GSH水平,降低MDA水平,减少细胞凋亡,提示GYKI-52466可能通过减轻氧化应激、抗凋亡机制发挥脑保护作用。 5. 新生鼠HIBD后出现远期学习记忆功能障碍,GYKI-52466治疗能显著改善HIBD新生鼠的学习记忆功能,提示早期干预对保护远期学习记忆功能有重要价值。
【图文】：

中位数,横线,缺氧缺血,黑点

图 2：纵坐标表示 L:RMBP值，黑点表示各例 L:RMBP值，横线表示中位数。与缺氧缺血组比较，，ap<0.02；bp<0.05。3.3 GYKI-52466 对 HIBD 新生鼠脑组织 NF-H 表达的影响缺氧缺血组左侧脑组织 NF-H 表达明显减少，以外囊、纹状体最为明显。图像分析仪测定左侧与右侧脑组织 NF-H 积分光密度值之比（L:RNF）。HI 后 1w，假手术组缺氧缺血组、干预组 L:RNF值有显著差异（p<0.001）。缺氧缺血组 L:RNF值明显小于假手术组（p<0.001），干预组 L:RNF值高于缺氧缺血组（p<0.05）（见表 1、图 3）。表 1 HI 后 1w 双侧脑组织磷酸化 NF-H 积分光密度比值(x_±s)例数 L:RNF值假手术组 6 0.990±0.010△△缺氧缺血组 6 0.475±0.106干预组 6 0.671±0.145△

积分光密度,脑组织,双侧,比值

图 3： HI 后 1w 双侧脑组织 NF-H 积分光密度比值（L:RNF）与缺氧缺血组比较，△p<0.05，△△p<0.001。-52466 干预后 HIBD 新生鼠海马 CA1 区神经元计数的变化术组海马有 4-5 层锥体细胞，排列整齐紧密；高倍镜下神经清晰可见，形同“鹰眼”。缺氧缺血组神经元明显减少，失乱，神经元胞体缩小或脱失，胞浆嗜酸性，胞核固缩或溶解组患侧海马 CA1 区细胞膜和核膜完整、核仁清楚的存活神组，GYKI-52466 干预组 CA1 区神经元数较缺氧缺血组明2、图 4）。表 2 HI 后 1w 患侧海马 CA1 区神经元计数 (x_±s)例数 CA1 区神经元数（个/毫米）0假手术组缺氧缺血组干预组
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R722.121

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