斑马鱼心脏发育相关基因tbx2的表达和功能研究

发布时间：2020-06-13 03:02

【摘要】： 第一部分斑马鱼tbx2基因在心脏发育中的时空表达谱分析 目的tbx2基因是T-box(Tbx，T盒)转录因子基因家族的成员之一，表达于胚胎发生中的多个组织和器官。在鼠的心脏发育中，表达于相对于非室腔心肌带的流出道、内弯、房室管和流入道。斑马鱼是研究心脏发育的理想模式生物，tbx2基因在斑马鱼心脏发育中的作用研究目前尚未见报道，作为探索tbx2基因功能的第一步，我们描绘了tbx2基因在心脏发育中的时空表达谱。 方法体外转录地高辛标记的反义tbx2 RNA探针，收集斑马鱼心脏发育相关时期的胚胎，进行整胚原位杂交。 结果tbx2在心脏中的表达首先发生于5体节期的前侧中胚层的两侧区域，受精后24小时(hpf)，表达于原始的心管，随后随着心管的发育，心房心室的形成，除了预期房室交界处外，逐渐在心管的大部分消失，36hpf后逐渐局限于房室管，96hpf表达消失。 结论整胚原位杂交是研究斑马鱼特定基因时空表达的良好方法。tbx2在斑马鱼心脏发育中的表达模式提示了tbx2可能与心脏房室的分化和房室管的形成有关；与鼠胚表达谱的对比说明了tbx2基因进化上时空表达谱的高度保守性，并且探测到tbx2在斑马鱼心脏发育中的最初表达早于鼠胚的心脏，提示tbx2基因对斑马鱼心脏发育的调节作用可能早于对鼠类心脏发育的影响。 第二部分斑马鱼tbx2基因阻抑和过表达心脏发育的表型研究 目的在对斑马鱼tbx2基因心脏发育时空表达谱分析的基础上，研究斑马鱼tbx2基因阻抑和基因过表达对心脏发育的影响，以说明tbx2基因在心脏发育中的作用。 方法吗啉修饰的反义寡核苷酸(MO)是进行基因抑制的良好方法。设计tbx2-MO和对照MO(c-MO)，在斑马鱼受精卵的单细胞期，进行不同浓度的显微注射，并通过荧光蛋白融合标记实验和tbx2-mRNA、tbx2-MO共注射拯救实验，验证tbx2-MO抑制tbx2基因表达的有效性和特异性；基因过表达是通过给斑马鱼受精卵注射体外合成的tbx2-mRNA，来研究tbx2基因功能获得对斑马鱼胚胎心脏发育的影响。 结果荧光蛋白融合标记实验验证了tbx2-MO可以很好得阻抑斑马鱼胚胎tbx2的表达，tbx2-MO组胚胎在心脏收缩性、节律和形态学发生上出现了异常，心脏畸形随着注射剂量的增加而出现比较一致的表型，而c-MO组胚胎没有出现明显的畸形；tbx2-mRNA和tbx2-MO的共注射减少了tbx2-MO胚胎心脏畸形的发生率及减轻了心脏畸形的程度，，验证了所设计合成的tbx2-MO对tbx2基因的抑制作用具有特异性；tbx2-MO组胚胎心脏缺陷包括心室发育不良、心房扩张、房室管和瓣膜异常以及心率缓慢、心律不齐、心脏停搏、血液返流等，并根据心脏发育异常的程度分为轻、中、重度畸形组tbx2-mRNA基因过表达胚胎没有见到心腔的形成。 结论斑马鱼是研究心脏发育的理想模式生物，MO基因阻抑是研究基因功能的良好方法。tbx2在房室特异性分化、房室管、瓣膜和传导系统形成方面起了重要的作用。 第三部分斑马鱼tbx2基因阻抑胚胎心脏标记基因表达分析 目的amhc、vmhc、nppa分别是心房、心室、心房心室肌早期分化的特异性标记基因，nkx2.5是心脏原基的分子标记，bmp4的表达最初发生于心脏的原基，最终局限于静脉窦—心房交界区、房室交界区及流出道，versican与房室管和瓣膜的形成密切相关。对tbx2-MO组胚胎进行以上心脏发育特异性标记基因的表达分析，以进一步阐明tbx2基因在斑马鱼心脏发育中的作用。 方法进行了以上心脏标记基因探针的构建，用整胚原位杂交的方法检测了tbx2-MO胚胎心脏相关基因的表达情况。 结果tbx2-MO组胚胎amhc表达范围增大，vmhc表达范围缩小，nppa表达强度明显增强，nkx2.5的表达基本正常，bmp4表达增强，36hpf在心房和心室还有较强的表达，并持续到48hpf，72hpf bmp4的表达仍然存在，静脉窦—心房交界区可见明显扩张；versican于36hpf后没有出现正常的退缩，心房心室部位异常表达，并且72hpf仍有持续表达。 结论斑马鱼tbx2基因阻抑胚胎心脏标记基因的表达分析进一步证实了tbx2基因阻抑胚胎心脏表型的变化，表明了tbx2在房室分化、房室管形成、瓣膜发育、流出道和静脉窦—心房交界区的形成等方面起着重要的作用。
【图文】：

心内膜细胞形成了内弯，大概是从圆锥腔的最初位置扩展而来，3OhPf，形成了心房和心室，36hPf，经历了心脏的环化，形成s环，环形的结果是心室在心房的右面，48hPf，功能性的瓣膜逐渐形成[17，18](图2):Pt551刘plg.slpl图2斑马鱼心脏发育模式图 (StainierDY，2001)瓣膜的功能是确保心脏血流正确地从心室流向流出道，而不是返流回心房，可见它对于心脏的功能及其重要。

即心内膜和心外膜的细胞外基质，形成心内膜垫 (endoeardialeushions)，后来逐渐重塑成纤维结构和非细胞结构为主的翼状瓣膜 (remodellingofcushion ereatesvalve)[1刀(图3):翔山尸图3斑马鱼心脏瓣膜发育模式图 (Staini6rDY，2001)5.斑马鱼基因功能研究常用的方法斑马鱼基因功能研究领域已经出现了日新月异的变化，常用的研究方法包括:l)基因突变结合拯救法(rescue)研究基因功能突变个体已经产生了，那么如何去研究突变性状与相关的基因的关系呢?把野生型斑马鱼的同一基因转录的mRNA注射到突变体的胚胎中，能够使发生突变的表型得以恢复，因此可以确定这一基因与突变表型的关系。编码斑马鱼 bonemorPhgenetieProtein一2(BMPZ)的基因发生突变导致swirl突变，而通过注射 BMpZmRNA就可以使突变体恢复正常或接近正常的形态。而即cloPs和squint突变体可以用转化生长因子p(TGF一p)家族的mRNA来恢复[1”]。当然，
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R725.4

【参考文献】

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本文编号：2710536