甲基丙二酸尿症的神经毒理机制研究及致病基因突变位点分析

发布时间：2020-06-13 13:56

【摘要】： 第一部分甲基丙二酸对大鼠心肌线粒体呼吸链复合酶Ⅱ的影响 【目的】甲基丙二酸尿症患者常常出现基底神经节特别是苍白球的变性坏死,研究显示这种特发性的神经损害可能与该病中累积的甲基丙二酸(MMA)、丙二酸、2-甲基柠檬酸等内源性毒性产物影响线粒体呼吸链的能量代谢及三羧酸循环有关。本次研究旨在探讨甲基丙二酸在线粒体能量代谢中的作用及可能的神经毒性作用机制。 [方法]使用差速离心法在体外构建大鼠心肌线粒体模型,用Bradford蛋白浓度测定法测定和调节线粒体蛋白浓度。用分光光度法和Western blot方法分别测定不同浓度(0mM,1 mM,2.5 mM和5 mM)和不同时间(30min,2 h,4h和8 h)孵育的甲基丙二酸对大鼠心肌线粒体呼吸链复合酶Ⅱ(complex II)的活性改变和其两种蛋白亚基铁硫蛋白30亚基(IP)、黄素蛋白70亚基(FP)表达水平的影响。 [结果]1.酶活性检测结果①甲基丙二酸孵育30 min和2 h时,各不同浓度处理组(1 mM,2.5 mM,5mM)的complexⅡ活性与对照组相比均无显著性降低(P均0.05)；②甲基丙二酸孵育4 h时,各不同浓度处理组的complexⅡ活性与对照组相比均有明显降低(P均0.05)；③甲基丙二酸孵育时间延长至8 h时,低剂量甲基丙二酸处理组(1 mM)的complexⅡ活性与对照组相比无显著性降低(P0.05),而中、高剂量组(2.5 mM,5mM)与对照组相比则有显著降低(P均0.05)；④甲基丙二酸孵育30min,2 h,4 h时各不同MMA浓度组的complexⅡ的活性值处于较稳定的水平,未见明显降低(P均0.05)；当孵育时间增加到8 h时,各浓度组的complexⅡ的活性值可见明显下降(P均0.05)。2. Western blot检测蛋白表达结果①MMA孵育30min时,各不同浓度的甲基丙二酸处理组(1 mM,2.5 mM,5 mM)的FP和IP表达水平均未见显著下调(P均0.05)；②甲基丙二酸孵育2 h时,各不同浓度的甲基丙二酸处理组(1 mM,2.5 mM,5 mM)的IP表达水平未见明显下调(P均0.05),FP表达水平各组均有明显下调(P均0.05)；③MMA孵育4 h时,各不同浓度的甲基丙二酸处理组(1 mM,2.5 mM,5 mM)的IP表达水平未见明显下调(P均0.05),FP表达水平各组均有明显下调(P均0.05)；④MMA孵育8 h时,各不同浓度的甲基丙二酸处理组(1mM,2.5 mM,5mM)的FP表达水平各组均有明显下调(P均0.05),低剂量处理组(1 mM)的IP表达水平与对照组相比没有显著性差异(P0.05),但中、高剂量处理组(2.5 mM和5 mM)IP表达水平较对照组有明显下调(P)均0.05)。 【结论】甲基丙二酸可引起线粒体呼吸链复合酶Ⅱ蛋白亚基IP和FP表达的下调及线粒体呼吸链复合酶活性降低,但存在时间依赖性和浓度依赖性的协同作用,这可能是甲基丙二酸引起线粒体能量代谢障碍和神经损伤的直接作用机制之一。 第二部分甲基丙二酸尿症患儿的临床特点以及基因突变分析 【目的】甲基丙二酸尿症是由甲基丙二酰辅酶A缺陷或其辅因子腺苷钴胺素代谢缺陷所致的一类遗传代谢缺陷病。根据不同病因可分为mut型(mut0和mut-型)和Cbl型(Cb1A、Cb1B、Cb1C、Cb1D、Cb1F和Cb1H型)。其中mut型是最多见的一种类型,其编码基因为位于6号染色体的MUT基因,目前在mut型病人中已发现的MUT基因突变已达200多种。本研究的目的旨在探讨华中地区甲基丙二酸尿症患儿临床特点与基因突变特点,并分析两者之间的相关性。 【方法】收集近年来在本院通过气相色谱-质谱分析技术(GC/MS)确诊为甲基丙二酸尿症患者(共18例)及双亲(共5对)的外周血标本,记录起病年龄、主要临床表现、生化异常、维生素B12反应性、治疗及随访等临床资料。使用传统方法从EDTA抗凝的外周血白细胞中提取DNA,针对编码甲基丙二酰辅酶A的MUT基因编码区外显子2-13及其邻近的内含子区域设计引物,PCR扩增纯化后应用Beckman CEQ8800基因分析系统直接进行测序,检测基因突变位点。 【结果】1.患者主要临床特征：18例患者(男13例,女5例)起病年龄在2天～14个月之间,临床表现以肌无力、喂养困难、呕吐、感染为主,生化异常以代谢性酸中毒和高氨血症最为常见。16号和17号患者为双胞胎兄弟,10号和12号患者均存在可能与本病相关的异常家族史。12名患者对维生素B12试验性治疗无反应性,3名患者有反应性,3名患者未检测。至本研究终止时已有14例患者死亡,存活者仅4例。2.基因突变特征：所有患者和家长DNA中均检测到基因突变或多态性,共14种,具体见下①6种为未报道的新突变,分别为c.424AG(p.T142A)、c.786TG (p.S262R)、c.808GC (p.G270R)、c.1323_1324insA、c.1445-1GA和c.1676+77AC,均为杂合突变；②其余8种突变和多态性分别为C.323GA (p.R108H)、c.636AG (p.K212K)、c.682CT (p.R228X)、c.1495GA (p.A499T)、c.1595AG (p.H532R)、c.1992GA (p.A664A)、c.2011GA (p.V671I)和c.1677-53AG,大部分为杂合突变；③5个家系分析中共发现7种突变,分别为c.636AG (p.K212K)、(p.A499)、c.1595AG (p.H532R)、c.1992GA (p.A664A)、c.2011GA(p.V671I)、c.1677-53AG和c.1676+77AC,仅一种为新突变,患儿的突变均来自于父方或母方。 [结论]本次研究发现了MUT基因6种目前尚未报道过的新突变,更新了MUT基因的突变谱；华中地区甲基丙二酸尿症患儿的主要致病基因突变类型可能与三种多态性(p.K212K、p.H532R和p.V671I)与其它突变相伴存在密切相关。
【图文】：

eontroll田 M2.5.M5口MMM几浓度图1一 2MMA孵育 30min时各不同浓度组的comPlexn活性②MMA孵育Zh时，各不同浓度的甲基丙二酸处理组 (lmM，， 2.5mM， 5mM)的eo哪 lex11的活性值分别为7.95士 1.52、6.90士 1.35、6.73士一15和6.19士0.95(IunOI加i川mg蛋白)，统计学分析 F=2.82， P>0.05，各处理组与对照组相比仍然没有显著性差异。吐ORJ

本文编号：2711278