调控Lingo-1表达对不同发育期脑惊厥持续状态后海马异常神经环路形成的影响

发布时间：2020-06-14 18:27

【摘要】：第一部分惊厥持续状态后不同时期不同发育期脑内海马神经环路结构的变化目的:探索幼年鼠及成年鼠惊厥持续状态(Status Convulsion,SC)后不同时期海马内神经环路中神经元髓鞘、轴突及突触的动态变化。方法:选用Sprague Dawley(SD)幼年鼠(生后21天龄[P21])及成年鼠(生后60天龄[P60]分为正常对照组和SC模型组。SC模型组采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导SC;采用电镜观察SC后不同时期髓鞘、突触形态结构变化,Western blotting检测SC后不同时期大鼠海马髓鞘碱性蛋白MBP、轴突生长抑制因子(Nogo A、OMgp、MAG)、突触囊泡蛋白(SYP)、AMPA受体各亚基、Lingo-1蛋白的表达变化;免疫荧光检测Lingo-1蛋白表达变化;以及比较SC所致的髓鞘、轴突及突触损伤在不同发育期脑内的差异。结果:(1)海马髓鞘自SC后1天开始即出现肿胀、分层,而后出现塌陷、空泡化,持续至SC后60天,且同时伴随髓鞘厚度及髓鞘蛋白MBP表达减少(P0.05)。(2)幼年鼠及成年鼠SC后20天海马内NF200阳性纤维数量减少且长度缩短(P0.05);同时SC后不同时期幼年鼠海马中OMgp和MAG表达有不同程度的增加,而成年鼠海马中OMgp表达明显增加(P0.05)。(3)与同龄正常对照组相比,幼年鼠SC后20天海马CA1区突触数目减少(P0.05),突触前膜活性带长度增加(P0.05),而突触后膜PSD厚度下降(P0.05);幼年鼠SC后1天SYP蛋白表达减少,SC后20天及60天表达增加(P0.05),而成年鼠SC后各个时期SYP蛋白表达持续减少(P0.05)。(4)幼年鼠SC后AMPA受体亚基以Glu R1/4亚基组成为主,其中Glu R2亚基SC后1天减少,而后短暂增加,至SC后60天减少(P0.05);而在成年鼠SC后AMPA受体亚基以Glu R1/3亚基组成为主,Glu R2亚基SC后呈持续减少(P0.05)。(5)幼年鼠及成年鼠海马内Lingo-1蛋白表在SC后5天开始增加持续至SC后60天(P0.05)。结论:SC后幼年鼠和成年鼠海马神经环路中的神经纤维髓鞘、轴突及突触结构均受到不同程度的损伤;Lingo-1信号可能参与了SC所致脑损伤病理过程;幼年鼠与成年鼠SC后髓鞘损伤程度及突触数目改变存在年龄差异,幼年鼠对SC所致髓鞘及突触损伤较成年鼠耐受性好。第二部分Lingo-1 shRNA慢病毒载体构建及转染动物模型验证目的:分别构建抑制或促进Lingo-1蛋白表达的shRNA慢病毒载体,并验证相应慢病毒载体转染至大鼠脑内后的功能。方法:分别构建抑制或促进Lingo-1蛋白表达的shRNA慢病毒载体。选用的幼年及成年SD大鼠,首先采用免疫荧光检测经侧脑室注射转染至脑内后慢病毒GFP表达分布情况;其次根据病毒滴度测定结果分别设置三个剂量等级,分别转染幼年鼠和成年鼠,通过western blotting检测病毒载体转染后海马内Lingo-1蛋白表达情况,筛选Lingo-1过表达慢病毒(OLV)最优干预剂量;最后,根据抑制及促进Lingo-1蛋白表达的shRNA慢病毒载体最优干预剂量,分别转染至大鼠脑内,并采用Western blotting分别检测转染后3天、7天、14天、28天大鼠海马内Lingo-1蛋白表达情况,验证各类病毒对Lingo-1蛋白表达的作用及选择最优干预时间。结果:(1)所使用慢病毒载体的滴度分别为抑制Lingo-1表达慢病毒载体(LV):1E+9TU/ml,Lingo1过表达慢病毒载体(OLV):1E+8TU/ml,阴性对照慢病毒载体(NC):5E+8TU/ml。(2)慢病毒载体能够经脑立体定位侧脑室注射成功转染至脑内后,且能在脑内扩布并感染皮层及海马细胞,持续时间至少为28天。(3)Lingo1过表达慢病毒载体对幼年鼠及成年鼠最优干预剂量分别为:5μl/只、8μl/只;抑制Lingo-1表达慢病毒载体对幼年鼠及成年鼠最优干预剂量参照课题组前期实验分别设定为:1.5μl/只、3μl/只;阴性对照病毒为:2.5μl/只、5μl/只。(4)采用分别最优剂量慢病毒载体干预后,抑制或促进Lingo-1表达慢病毒均分别在7天、14天、28天对海马内Lingo-1蛋白表达产生明显抑制或促进作用(P0.05)。结论:所构建慢病毒载体经侧脑室注射转染至脑内后对海马Lingo-1蛋白表达能达到预期效果。第三部分抑制或促进Lingo-1基因表达对惊厥持续状态后海马异常神经环路形成的影响目的:探讨调控Lingo-1表达能否影响SC所致髓鞘、轴突、突触损伤,及影响癫痫发生。方法:以第一部分实验大鼠作为慢病毒未干预组(NI),包括2个亚组即正常对照组(NI-Control)和SC模型组(NI-SC)。另外再重新选用15天龄大鼠和54天龄大鼠分别予以慢病毒干预,根据干预慢病毒类型不同分为:NC病毒干预组(NC)、LV病毒干预组(LV)、OLV病毒干预组(OLV)。各个大组分别分为2个亚组,其中一个作为对照组,另一个组采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射诱导SC作为SC模型组。比较不同慢病毒干预对腹腔注射氯化锂-匹罗卡品SC诱导潜伏期的差异;采用电镜观察SC后不同时期髓鞘、突触形态结构变化,Western blotting检测SC后不同时期大鼠海马髓鞘碱性蛋白MBP、轴突生长抑制因子(Nogo A、OMgp、MAG)、突触囊泡蛋白(SYP)、AMPA受体Glu R2亚基、Lingo-1蛋白的表达变化;Timm染色观察苔藓纤维芽生;以及动态监测SC后不同时期各组大鼠脑电活动变化情况。结果:(1)幼年鼠及成年鼠不同慢病毒干预组惊厥潜伏期较同龄未干预组无显著统计学差异(P0.05),但幼年鼠与成年鼠相同干预组间相比,幼年鼠的惊厥潜伏期更短。(2)抑制Lingo-1蛋白表达后能有效增加有髓神经元髓鞘厚度,并减轻SC所致髓鞘损害减轻(P0.05)。促进Lingo-1表达后将减小有髓神经元髓鞘厚度,且SC后仍遗留严重髓鞘损害(P0.05)。(3)抑制Lingo-1蛋白表达后能够明显增加幼年鼠及成年鼠海马内MBP表达水平,并削弱SC对MBP表达的影响(P0.05)。促进Lingo-1表达后将减少幼年鼠及成年鼠海马内MBP表达水平,且SC后MBP表达仍维持较低水平(P0.05)。(4)Timm染色结果显示抑制Lingo-1表达后能够显著减少幼年鼠及成年鼠SC后20天海马CA3区MFS的发生(P0.05);促进Lingo-1表达对幼年鼠及成年鼠SC后海马CA3区MFS发生无显著影响(P0.05);且正常情况下随着年龄增加,CA3区苔藓纤维颗粒逐渐增加,SC后成年鼠海马CA3区苔藓纤维芽生均较幼年鼠明显。(5)抑制Lingo-1表达或促进Lingo-1表达后幼年鼠海马内轴突生长抑制因子(Nogo A、OMgp、MAG)表达均在SC后不同时期均有不同程度的减少(P0.05);而对成年鼠主要为OMgp表达在SC后60天减少(P0.05)。(6)抑制或促进Lingo-1表达均能使SC后20天海马CA1区突触数目增加。(7)抑制Lingo-1表达能改善SC后20天海马突触PSD厚度的减小(P0.05)。促进Lingo-1表达将导致SC后海马CA1区突触PSD厚度及活性带长度均减小(P0.05)。(8)抑制Lingo-1表达能改善幼年鼠海马内SC所致SYP表达改变(P0.05),但对成年鼠SC后SYP表达无显著影响(P0.05)。促进Lingo-1表达能够显著抑制幼年鼠海马内SC后各个时期SYP的表达(P0.05),而促进成年鼠SC后海马内SYP表达(P0.05)。(9)抑制Lingo-1表达将抑制幼年鼠SC后Glu R2表达(P0.05),促进成年鼠SC后60天Glu R2的表达(P0.05);促进Lingo-1表达将增加幼年鼠SC后60天Glu R2表达(P0.05),而减少成年鼠SC后60天Glu R2亚基表达(P0.05)。(10)脑电图动态监测结果显示抑制Lingo-1表达能够减轻SC后20天EEG痫性放电的严重程度(P0.05),但是对痫性放电发生次数无明显影响;促进Lingo-1的表达对SC后EEG痫性放电无明显改善但也无显著加重(P0.05)。结论:抑制Lingo-1表达能够改善不同发育期脑SC所致髓鞘、轴突及突触超微结构损害;促进Lingo-1表达对不同发育期脑SC所致髓鞘、轴突及突触超微结构损害无显著影响;抑制或促进Lingo-1表达均不能改变SC后脑电图痫性放电的次数,但是抑制Lingo-1表达能够减轻脑电图痫性放电的严重程度。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R720.597

【参考文献】