X-染色体连锁的凋亡抑制剂（XIAP）对新生鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

发布时间：2020-06-15 01:57

【摘要】： 新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxia ischemia brain damage,HIBD)是造成小儿中枢神经系统损害的重要原因，其发病机制尚不完全清楚且无特效治疗措施。因此积极地阐明HIBD发病机制及寻找积极有效的治疗措施成为国内外共同关注的课题。新近研究发现，神经元凋亡在HIBD的发病机制中占有重要地位，其中，一组半胱氨酸蛋白酶即Caspase在凋亡的发生中发挥关键作用。IAPs(inhibitor of apoptosis)家族是哺乳动物体内唯一的内源性凋亡抑制剂家族，其中X—连锁的凋亡抑制剂(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)不但能抑制调控Caspase(Caspase-9)的活化，还能抑制效应Caspase(Caspase-3、-7)的活化，因而具有全面抗凋亡作用。国内外尚未见有关XIAP对新生鼠HIBD的保护作用的研究。本研究采用XIAP转基因新生小鼠在缺氧缺血后以脑损伤神经病理学评分、脑组织丢失体积、脑梗塞体积、脑萎缩体积、脑损伤程度肉眼积分、脑内Caspases活性等作为观测指标，探讨XIAP过度表达对HIBD的保护作用及其机制。对象： (1) XIAP过度表达组(XIAP组)：新生9日龄XIAP过度表达转基因C_(57)BL／6型小鼠79只，不拘性别，随机又分为缺氧缺血(Hypoxia Ischemia,HI)后3h组12只；24h组12只；72h组11只；5d组26只。生后9d及12d正常对照组各9只。 (2) 野生型组(Wt组)：同期新生9日龄野生型C_(57)BL／6小鼠82只，不拘性别，随机又分为HI后3h组11只；24h组10只；72h组9只；5d组31只； 2003年硕士研究生毕业论文 X一染色体连锁的凋亡抑制剂(x IAP)对新生鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用生后gd及12d正常对照组分别为11只和10只。各组动物在体重、性别、年龄等方面均无显著差异。方法: (1)新生鼠HIBD模型制做:9日龄新生小鼠经3一4%氟烷吸入麻醉后，解剖显微镜下结扎左侧颈总动脉，于手术记时Zh后吸入9.9%氧气60min，对照组动物既不手术也不缺氧。 (2)微管相关蛋白一2(MAPZ)免疫组化染色:Hl后5d，副醛经心脏灌注处死动物，取出脑组织固定后，常规脱水包埋，切片、片厚5林m。每50张取一张，ABC法进行MAP:免疫组化染色。 (3)C哪ases活性测定:9日龄新生小鼠Hl后3h、24h、72h及gd、1 Zd 正常对照断头取脑分离出左右大脑皮层，手工匀浆，4℃92009离心1 smin，上清液为胞浆成份用于casPases的活性测定。 (4)XIAP和XIAP相关因子一l(Xl砂一assoeiated factor一l，XAF一l)免疫荧光染色:观察XIAP与XAF一1在神经细胞中的的分布及相互关系。 (5)研陌stemblot:测定脑组织XIAP蛋白表达变化。 (6)脑梗塞体积的测量:将M妙2免疫组化切片(每50张取l张，片厚扣m)利用Micro Image软件测量每张切片MAPZ阴性区域面积及阳性区域面积，利用公式计算梗塞体积。 (7)脑损伤神经病理学评分:结合MAP:免疫组化染色和常规HE染色，依据神经病理学评分标准对脑组织损伤程度进行评分。 (8)统计学处理:所有结果均以X士SD表示，均数的比较采用非配对t 检验。P0.05为差异显著，统计数据利用statView软件运行。结果: (1) WestemBfot结果显示，XIAP表现为57kDa的单一条带，半定量分析发现XIAP表达在转基因组明显高于野生型组。 (2)HI后sd，XIAP过度表达小鼠脑损伤神经病理学评分在皮层、海马、纹状体、丘脑各部位均较野生型小鼠明显降低，其下降程度分别为皮层29.9% (P0.0001)，海马19，2%(P0.001)，纹状体13.5%(P=0.003)，丘脑10.3%(P=0.035)。 2003年硕士研究生毕业论文 X一染色体连锁的凋亡抑制剂(xIAP)对新生鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 (3)Hl后sd，XIAP组脑损伤程度肉眼积分、脑组织丢失体积、萎缩体积及脑梗塞体积均明显小于野生组(P0.0001，P0.0001，P0.0001，P0.05)。 (4)Hl后野生组Caspase一3活性在3h即明显升高(p0.0004)，24h达到峰值(p0.0001)，在72h仍明显高于正常对照组。XIAp组Ca印ase一3活吐在Hl 后24h较正常对照组明显增加(P0.0001)，但在Hl后3h及72h与正常对照组相比无差异。Hl后各时间点CasPase一3活性升高程度在两组中存在明显差别，野生组升高更为显著。 (5)Hl后24h，XIAp组Caspase一9活胜明显低于野生组(p=0.0008)。 (6) XIAP与XAF一1免疫荧光双染色显示，X认P分布在胞浆，XAF一1 分布在细胞核，XIAP与XAF一1共同阳性的细胞表现为核浓缩。结论: (l)转基因后XIAP过度表达的小鼠在Hl后脑组织神经病理学积分、脑组织丢失体积、梗塞体积、萎缩体积、损伤程度肉眼积分均低于野生组，说明XIAP 对HIBD有保护作用。 (2) XIAP过度表达导致Hl后Caspases活性受到抑制，说明XIAP通过抑制Caspases活性而起到脑保护作用。 (3)HI后部分XIAP与XAF一1双标记的细胞表现为核浓缩，呈现凋亡的核形态改变，表明XIAP的抗凋亡作用还存在着某些负调节机制。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R722.121

【相似文献】