低碱性磷酸酯酶症患儿的骨髓间充质干细胞和乳牙牙髓干细胞生物学行为的实验研究

发布时间：2020-06-21 20:43

【摘要】： 低碱性磷酸酯酶症(Hypophospatasia,HPP)是一种常染色体隐性遗传疾病,由于碱性磷酸酯酶(ALPL)基因突变而导致的以骨骼和牙齿发育缺陷及血清、骨的组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)活性降低为特征的一种系统性疾病。由于ALPL的等位基因异质性,该疾病的临床表型高度变化,轻者仅表现为乳牙过早脱落,严重情况下可出现严重骨骼异常及高钙血症导致围产期死亡,目前已发现214个ALPL基因突变类型可导致HPP疾病的发生。ALPL编码的TNAP蛋白不仅在生物矿化过程中具有至关重要作用,而且可能通过影响相关干细胞的生物学行为导致骨骼及牙齿发育异常。本实验首先对HPP患儿进行基因突变检测,进而体外培养和检测HPP患儿脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)以及骨髓间充质干细胞(BMMSC),以期探讨ALPL基因突变对SHED及BMMSC生物学特性及分化行为的影响,为深入阐明低碱性磷酸酯酶症的致病机制提供一定实验依据和研究基础。所取的研究结果如下。 实验一低碱性磷酸酯酶症患儿致病基因ALPL突变检测的研究 本实验通过PCR及基因测序等方法对1名HPP患儿致病基因ALPL基因的外显子(EXON)进行基因组DNA序列分析,进而检测基因突变的类型和位点。结果显示,该HPP患儿ALPL基因的第7个外显子,基因序列第787位点发现了一个T→C的错义突变,为杂合型结构,该点突变导致密码子TAC→CAC,可引起编码蛋白第263位点酪氨酸变成组氨酸,而其家系健康成员及正常对照均显示为野生型序列。经过数据库和文献检索,本实验发现的ALPL基因突变型(c.787TC, p.Y263H)未见报道,初步认为此基因型单倍体不足是导致该HPP患儿临床表型的致病原因。 实验二低碱性磷酸酯酶症患儿乳牙牙髓干细胞的生物学行为研究 本实验首先进行低碱性磷酸酯酶症患者乳牙牙髓干细胞和正常乳牙牙髓干细胞的体外培养,进而通过免疫细胞化学的方法对两组细胞表面分子标记物表达分析,采用克隆形成率,Ki67阳性率,MTT,流式细胞方法检测两组干细胞增殖能力及凋亡水平的差异,茜素红染色,Real-time PCR检测两组细胞的矿化能力。结果发现:HPP细胞的成骨相关指标ALP、BSP、COL1等蛋白表达水平均略低于正常对照组;而增殖检测显示HPP细胞的细胞扩增水平较低;运用茜素红染色看出HPP细胞形成矿化结节明显较少; Real-time PCR检测发现RUNX2的mRNA表达下调,而ALP、COL1、DSPP等的表达上调。结果提示HPP细胞较正常对照组有着较弱的增殖能力和矿化能力。 实验三低碱性磷酸酯酶症患儿骨髓间充质干细胞的生物学行为研究 本实验首先体外培养低碱性磷酸酯酶症患者骨髓间充质干细胞和正常骨髓间充质干细胞,进而通过免疫细胞化学和流式细胞方法对两组细胞表面分子标记物表达分析,采用MTT,碱性磷酸酶活性检测,流式细胞方法检测两组干细胞增殖能力及凋亡水平的差异,茜素红染色,ALP活性染色,Real-time PCR检测两组细胞的矿化能力。结果发现:HPP细胞的成骨相关指标ALP、BSP、COL1等蛋白表达水平均略低于正常对照组;流式细胞的表面分子鉴定两组细胞表达量无明显差异;而增殖检测显示HPP细胞的细胞扩增水平较低;运用茜素红染色和ALP活性染色看出HPP细胞形成矿化结节明显较少;Real-time PCR检测发现RUNX2的mRNA表达下调,而ALPL、COL1、BSP等的表达上调。结果提示HPP细胞较正常对照组有着较弱的增殖能力和矿化能力。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R725.9
【图文】：

患儿ALPL基因EXON7正向测序结果

患儿ALPL基因EXON7反向测序结果

【引证文献】

相关期刊论文 前1条

1 秦晗;龚永庆;徐宏志;;乳牙早脱1例[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2011年06期

本文编号：2724615