肠道病毒71型感染人Jurkat细胞模型的建立及其对γ-干扰素分泌的影响

发布时间：2020-06-29 15:31

【摘要】：第一部分肠道病毒71型感染人Jurkat细胞模型的建立目的建立肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)体外感染人Jurkat细胞模型。方法EV71毒株由广西疾病预防控制中心于2008年从手足口病患者粪便中分离获得并保存。EV71病毒以感染复数(Multiplicity of infection,MOI)=5的条件感染生长旺盛的Jurkat细胞,同时设立正常对照组,每天在倒置显微镜下观察并记录病毒致细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),并于感染24小时后收集细胞,采用逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和悬浮细胞免疫荧光染色方法验证EV71能否感染人Jurkat细胞。结果1.RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示,EV71感染人Jurkat细胞的扩增条带与阳性对照EV71感染横纹肌肉瘤细胞(Rhabdomyosarcoma cells,RD)的目的条带位置相符;阴性对照未感染EV71人Jurkat细胞则未见条带。RT-PCR结果证实EV71可感染人Jurkat细胞。2.悬浮细胞免疫荧光染色结果显示,EV71抗原可与EV71特异性单克隆抗体结合,在荧光显微镜下可观察到EV71感染的Jurkat细胞EV7l免疫反应阳性,阳性细胞的胞体为绿色荧光,并覆盖胞核;阴性对照未感染EV71 人Jurkat细胞则未见染色。免疫荧光染色结果证实EV71可感染Jurkat细胞。3.倒置显微镜下观察EV71感染人Jurkat细胞可引起CPE反应,细胞体积增大,呈气球样改变,胞核肿胀,胞浆呈颗粒样变化,胞膜边缘不整齐,细胞逐渐破碎死亡;正常对照组细胞则未见CPE反应。结论成功建立EV71体外感染人Jurkat细胞模型,为进一步的发病机制的研究奠定基础。第二部分肠道病毒71型感染人Jurkat细胞模型对γ-干扰素分泌的影响目的在分子水平和蛋白水平上探讨EV71感染对人Jurkat细胞γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)分泌的影响。方法EV71病毒以MOI=5的条件感染Jurkat细胞,同时设立正常对照37℃培养,收集感染6小时、24小时、48小时和72小时的感染组和正常对照组细胞和细胞培养上清。Trizol法提取细胞总RNA,逆转录合成c DNA,以目的基因IFN-γ和内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为模板进行实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)。根据目的基因IFN-γ和内参基因GAPDH的Ct值,采用相对定量2-ΔΔCt方法计算IFN-γ的m RNA相对表达量,Fold Change为感染组相对未感染组基因的相对表达倍数。采用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养上清中细胞因子IFN-γ的分泌水平。采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,各组IFN-γ的分泌水平之间的差异是否有统计学意义。结果1.Real-time PCR检测结果显示,72小时感染组IFN-γ的m RNA相对表达量为2.62±0.79,与48小时感染组之间比较差异无统计学意义(P0.05),高于24小时感染组(P0.05),明显高于6小时感染组和正常对照组(P0.01);48小时感染组IFN-γ的m RNA相对表达量为2.37±0.87,与24小时感染组之间比较差异无统计学意义(P0.05),明显高于6小时感染组和正常对照组(P0.01);24小时感染组(1.48±0.77)、6小时感染组(0.96±0.19)和正常对照组(1.00±0.00)IFN-γ的m RNA相对表达量之间比较差异无统计学意义(P0.05)。2.ELISA检测结果显示,在感染EV71的Jurkat细胞与未感染EV71的Jurkat细胞中IFN-γ均仅有极低量表达,正常对照组、6小时感染组、24小时感染组、48小时感染组和72小时感染组IFN-γ的分泌水平之间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论1.在分子水平上,EV71感染可引起人Jurkat细胞中IFN-γm RNA的表达水平升高,其升高水平与感染时间相关。2.在蛋白水平上,EV71感染人Jurkat细胞中细胞因子IFN-γ无明显表达。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.1
【图文】：

Jurkat细胞,琼脂糖凝胶电泳,细胞,条带

和琼脂糖凝胶电泳验证 EV71 能否感染人 Jurk证 EV71 能否感染人 Jurkat 细胞，我们使用 EV71 Jurkat 细胞，同时设立阳性对照（RD 细胞）和阴时后收集细胞，用 Trizol 法提取细胞总 RNA，以进行 PCR 检测。结果如图 1-1 所示，第 1 泳道是的 RD 细胞，可见 934bp 的目的条带；第 2 泳道胞，可见扩增条带与阳性对照目的条带位置相符照的未感染 EV71 的 Jurkat 细胞。EV71 感染人性对照 EV71 感染 RD 细胞的目的条带位置相符Jurkat 细胞则未见条带。RT-PCR 结果证实 EV71

悬浮细胞,免疫荧光染色

图 1-2 悬浮细胞免疫荧光染色验证 EV71 能否感染图-EV71：为 EV71 感染的 Jurkat 细胞；图-DAPI-1：为 DAPI 图-Merged：为图-EV71 和图-DAPI-1 的叠加；图-Mock：为未图-DAPI-2：为 DAPI 染色的未感染 EV71 Fig.1-2 EV71-infected Jurkat cells demonstrated using suspstaining(400×)[Detection of EV71 antigen in EV71-infected mmunofluorescence staining.Jurkat cells were incubated with EV7

【参考文献】