NgR特异性小干扰RNA对新生大鼠HIBD神经再生功能的影响

发布时间：2020-07-03 19:04

【摘要】：目的: 1.化学合成NgR特异性小干扰RNA(siRNA),观察siRNA对具有神经元分化潜能的克隆细胞系PC12细胞的NgR mRNA和蛋白表达的影响。 2.探讨NgR特异性siRNA活体动物应用的效果,观察NgR沉默对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后神经轴突再生和功能的影响,为进一步应用载体长效表达siRNA治疗新生儿缺氧缺血性脑病提供理论依据。 方法: 1.培养大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12细胞,用神经生长因子(NGF)诱导使其分化为类神经细胞,化学合成大鼠NgR特异性siRNA,使之转染PC12细胞,采用实时荧光定量PCR及Western blot检测NgR基因及蛋白的表达,以检测干扰的效率。 2.60只SD新生大鼠随机分为假手术组、模型(HIBD)组、NS+转染试剂对照组、siNgR+转染试剂治疗组,结扎新生6天大鼠左侧颈总动脉合并缺氧建立HIBD模型,脑室内注射siNgR/NS+转染试剂,新生大鼠造模72h后连续3天侧脑室注射给药,用药3天后检测脑组织中NgR mRNA及蛋白的表达;用药2周后进行水迷宫实验,并检测脑组织GAP-43的表达,观察神经再生情况。 结果: 1.NgR特异性siRNA可以实现大鼠PC12细胞内源性NgR基因沉默,实时荧光定量PCR及Western blot结果显示,NgR mRNA及蛋白与对照组比较表达均降低,且差异具有显著性(P0.05)。 2.结扎P6新生SD大鼠左侧颈总动脉合并缺氧建立新生大鼠缺氧缺血性脑白质损伤模型,造模后连续3天脑室内注射NgR siRNA(30mnol)+转染试剂,处理后72hRT-PRC凝胶电泳结果显示,NgR条带消失,而盐水+转染试剂对照组NgR条带清晰可见,而两组管家基因GAPHD条带清晰;且免疫组化显示NgR siRNA治疗组NgR蛋白表达减少。 3.用药21天后进行水迷宫实验检测大鼠平均逃生时间,结果显示显示治siNgR治疗组较HIBD组逃生时间缩短,差异具有显著性(P0.05);而与假手术组比较无显著性差异。(P0.05)。 4.免疫组化检测脑组织GAP43蛋白表达,结果显示siNgR治疗组较HIBD组蛋白表达增多,且差异有显著性(P0.05),而与假手术组比较无显著性差异(P0.05)。 结论: 我们在细胞水平的实验证实:化学合成的NgR特异性siRNA能够抑制大鼠PC12细胞NgR mRNA和蛋白的表达;在新生大鼠HIBD动物模型中的实验结果证实:转染NgR特异的siRNA能够干扰大鼠NgR mRNA和蛋白表达水平,在一定程度上促进大鼠神经功能的恢复和神经纤维再生,是HIE后药物治疗可能的选择之一。NgR特异siRNA促进新生大鼠神经功能恢复可能的作用机制是:通过特异性下调NgR表达,阻断其与配体(Nogo、MAG、Omgp)的结合,从而对抗三种髓磷脂相关抑制物的轴突再生抑制作用,为中枢神经轴突再生提供良好的环境而获得。
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R722.1
【图文】：

3.2 转染效果的观察按照说明书的步骤，将含有绿色荧光标记的阴性序列 siRNA 的转染反应液与PC12 细胞闭光共孵育 6h 后，弃去转染反应液，用 PBS 洗 1-2 遍，把没有转染进去而残留在培养基或附在表面的荧光标记 siRNA 洗掉。注意洗涤时小心，不要使细胞洗脱落，检测时先使光路先对准未转染荧光标记 siRNA 的孔，调好焦距后转向对准转染孔，打开激发光后马上观察拍照，并在同一视野中拍下明场的细胞照片。可见细胞发出绿色的荧光，无细胞区域则无荧光，表明绿色荧光标记的阴性序列 siRNA已成功转染进入 PC12 细胞（图 2A-B）。图1A：未经NGF诱导的PC12细胞形态 (10×10）图 1B：NGF 诱导培养 24hPC12 细胞形态 (10×10）

3.2 转染效果的观察按照说明书的步骤，将含有绿色荧光标记的阴性序列 siRNA 的转染反应液与PC12 细胞闭光共孵育 6h 后，弃去转染反应液，用 PBS 洗 1-2 遍，把没有转染进去而残留在培养基或附在表面的荧光标记 siRNA 洗掉。注意洗涤时小心，不要使细胞洗脱落，检测时先使光路先对准未转染荧光标记 siRNA 的孔，调好焦距后转向对准转染孔，打开激发光后马上观察拍照，并在同一视野中拍下明场的细胞照片。可见细胞发出绿色的荧光，无细胞区域则无荧光，表明绿色荧光标记的阴性序列 siRNA已成功转染进入 PC12 细胞（图 2A-B）。图1A：未经NGF诱导的PC12细胞形态 (10×10）图 1B：NGF 诱导培养 24hPC12 细胞形态 (10×10）

【参考文献】

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本文编号：2740049