小儿肾母细胞瘤免疫治疗的初步研究

发布时间：2020-07-15 21:28

【摘要】： 目的：对小儿肾母细胞瘤新型疫苗进行初步探索、研究，为小儿肾母细胞瘤的治疗以及替代手术后放、化疗提供新的切入点。方法：首先对必需的实验材料进行制备和验证，包括抗体的制备和肿瘤细胞模型的建立。针对小儿肾母细胞瘤WT1基因，选取三段抗原表位肽HLA-A*0201、HLA-A*2402以及经过修饰的HLA-A*2402(命名为HLA-A*2402x)，采用短肽合成及Balb／c小鼠免疫检测的方法筛选最佳的抗原表位肽，为小儿肾母细胞瘤新型疫苗的研究奠定基础。用筛选得到的表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x分别构建DNA疫苗，为最终研制新型疫苗作对照。采用基因重组技术分别将克隆编码的小儿肾母细胞瘤WT1表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x融合到乙型肝炎核蛋白基因片段(HBc)上，运用棒状杆菌表达系统对融合蛋白进行表达，通过电镜观察到的融合蛋白呈病毒样颗粒(VLP)。继而采用免疫荧光技术和WB技术对表达的蛋白进行鉴定。将鉴定好的VLP蛋白和DNA疫苗应用于细胞模型进行研究，然后，分别免疫Balb／c小鼠，采用ELISA、FCM、MTT等免疫学实验技术分别检测，初步判断基于WT1表位肽HLA-A*2402、HLA-A*2402x构建的以VLP为呈现载体的重组蛋白，应用于治疗小儿肾母细胞瘤以及探讨替代手术后放、化疗的可行性。结果： (1)制备完成合格的实验材料：对小儿肾母细胞瘤细胞进行了成功的原代培养，建立了细胞系用于实验研究；克隆了WT1基因部分片段的原核表达质粒，表达并纯化了蛋白，免疫家兔，采集血清制备了针对WT1的多克隆抗体。 (2)MTS及FCM初步证明，合成短肽HLA-A*2402，HLA-A*2402x在刺激淋巴细胞增殖方面优于HLA-A*0201，而前两者无显著性差异(p＞0.05)。因此，我们选择HLA-A*2402，HLA-A*2402x作为进一步研究的对象。 (3)构建了含有HLA-A*2402，HLA-A*2402x的两种DNA疫苗，双酶切及测序结果证明构建成功。 (4)在HBc与HLA-A*2402，HLA-A*2402x偶联(couple)基础上，构建完成以VLP为呈现载体的新型疫苗，双酶切和测序结果证明构建成功。成功运用棒状杆菌表达系统对偶联蛋白进行表达，并得到WB和电镜检测证实。 (5)运用以VLP为呈现载体的新型疫苗免疫Balb／c小鼠，并以构建的DNA疫苗作为对照，结果表明以VLP为呈现载体的新型疫苗免疫小鼠产生了有效的特异性体液免疫和细胞免疫。抗体亚型分类表明特异性IgG1／IgG2a小于1，说明产生了Th1型为主的免疫应答。T淋巴细胞增殖试验证实免疫小鼠脾脏T淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应增强；ELISPOT分析表明疫苗免疫组的特异性活化的可分泌IFN-γ的CD8~+T细胞数显著多于对照组；FCM检测表明，疫苗免疫组的CD4~+／CD8~+比值显著低于对照组。这些结果提示以VLP为呈现载体的新型疫苗诱导了特异性CD8~+T淋巴细胞应答，所激发的细胞免疫和体液免疫均明显优于DNA疫苗对照组。结论：所制备的小儿肾母细胞瘤以VLP为呈现载体的新型疫苗在小鼠体内可同时激发体液免疫和细胞免疫，优于相应的DNA疫苗，为小儿肾母细胞瘤的免疫治疗提供了新的方法和思路。更为重要的是能将病毒有关成分引入到小儿肾母细胞瘤的免疫治疗。
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R737.11
【图文】：

肾母细胞瘤,组织病理,小儿

小儿肾母细胞瘤免疫治疗的初步研究图2FigZ鼠源性肾母细胞瘤组织病理切片 WilmstumorPathologiealseetion.3多克隆抗体的制备:运用ELISA方法检测制备的抗体效价可达到1:64000，因为是针对肿瘤多种蛋白的抗体，分析针对WTI的抗体效价可能没有那么高，因此在以后的实验中需要对有效抗体浓度进行实际验证。以上研究表明，我们己经成功的建立了小儿肾母细胞瘤的细胞系，同时通过动物模型的建立制备了鼠源性小儿肾母细胞瘤的肿瘤细胞;制备了高效价的肿瘤多克隆抗体。以上结果为本实验研究的顺利进行奠定了基础。

真核,重组质粒,条带,目的

三、实验结果 3.1HLA一A*0201一HBe/veDNA:3.1(+)、HLA一A*2402一HBe/peDNA:玉.1(+)、llLA一A*2402x一HBe/peDNA3.1(+)PCR及双酶切鉴定(图3):图3重组真核质粒PCR和双酶切鉴定 F19:亏 engymedigestionandPCRofrceombinantplasmidpeDNA:飞.1(+):A，IllA一A*0201一HBe/peDNA:亏.1(+);B，HIA一A*2402一11Be/peDNA;3.1(+)C，IllA一A*2402x一l{Be/peDNA:3.1(+)三种重组质粒经过PCR和双酶切进行初步鉴定，结果如上图所示，PCR和酶切目的条带与预期大小一致。

重组DNA疫苗,瞬时表达,细胞的

军医进修学院博士学位论文 3.2HLA一A*0201一HBe/peDNA3.l(+)、HLA一A*2402一HBe/pcDNA3.l(+)、HLA一A*2402x一HBe/ pcDNA3.1(+)COS一7细胞瞬时表达免疫细胞化学结果(图4):图4重组DNA疫苗在COS一7细胞的瞬时表达 Fig4ExpressionofDNAvaeeineinCOS一7:A， negativeeontro1B，一A*0201一HBe/peDNA3.1(+)C，HLA一A*2402一HBe/peDNA3.1(+)D，HLA一A*2402x一HBe/peDNA3.1(+)运用COS一7细胞进行瞬时表达，结果显示如上图。B、C、D为重组质粒转染免疫细胞化学结果，图中细胞内可明显地观察到黄褐色颗粒，即为表达的重组蛋白。所有的重组质粒在COS一细胞中都能够瞬时表达，为进一步实验奠定基础。3.3候选DNA疫苗免疫小鼠淋巴细胞亚群分析:

【参考文献】