3日龄未成熟大鼠缺血缺氧脑损伤后近远期运动和认知发育评价

发布时间：2020-07-24 17:45

【摘要】： 目的早产儿围生期脑损伤多伴有运动、神经行为和认知发育异常，以往关于早产儿脑损伤的动物实验研究多注重脑组织形态学和生化指标的改变，但实验动物脑损伤后神经行为、运动、认知发育评价也同样重要。本实验目的在于观察3日龄未成熟大鼠结扎双侧颈总动脉缺氧缺血脑损伤后少突胶质细胞超微结构及脑白质组织学变化，了解存在脑损伤的未成熟大鼠幼鼠期、青春期、成熟期神经行为、运动和认知损害程度，建立用于早产儿缺氧缺血脑损伤研究的合适动物模型，探讨相关时期脑白质病理变化与大鼠行为运动障碍的关系。 方法将3日龄SD未成熟新生大鼠共30窝(共360只)通过随机数字表随机分为两组：对照组和实验组。对照组仅切开颈部皮肤，而实验组结扎双侧颈总动脉。采用透射电镜染色、组织切片HE染色、少突胶质细胞前体细胞O_4标记和细胞凋亡免疫组化双标、免疫组化标记髓鞘碱性蛋白，观察未成熟大鼠脑白质损伤的超微结构病理变化、少突胶质细胞凋亡、髓鞘蛋白的表达水平。生后1周至3周检查两组大鼠体重、睁眼、竖耳、门齿萌出等生理发育情况，检测眼睑反射、耳廓反射、惊跳反射、翻正反射、四肢放置及抓握反射、趋地反射等原始反射，并进行神经行为发育评价；生后3周至6周通过步伐失误实验、垂直网屏实验、平衡木实验、转棒实验评估两组大鼠运动协调性、伸肌功能、平衡能力和运动耐力发育；生后7周至13周通过水迷宫实验评价大鼠脑损伤远期认知水平发育。 结果①对照组存活率为100％(120只／120只)，实验组存活率为51.3％(123只／240只)。实验组有87.8％(108只／123只)存在眼部发育障碍。②生后1至3周实验组大鼠体重增长较对照组明显缓慢，差异有统计学意义(P＜0.05)。生后3周实验组脑重较对照组减轻，实验组为1.06克±0.02克，对照组为1.46±0.04克，差异有统计学意义(P＜0.01)。③透射电镜术后6小时见实验组大鼠脑室周白质少突胶质细胞及其线粒体、内质网、高尔基体水肿明显，见线粒体数目减少和空泡现象，粗面内质网脱颗粒。术后12小时实验组少突胶质细胞可见细胞核染色质分布不均。术后24小时实验组少突胶质细胞广泛核固缩。④组织切片HE染色见实验组早期皮质下、脑室周白质疏松，后期胶质细胞增生、脑室扩大、白质软化灶形成；凋亡细胞经荧光标记后显示为少突胶质细胞前体细胞；生后3周实验组大鼠髓鞘相关蛋白表达减少。⑤实验组大鼠出现眼睑反射的日龄为11.0±0.6天，相比对照组8.0±0.4天有明显延迟，差异有明显的统计学意义(P＜0.01)。实验组出现惊跳反射的时间为11.2±0.9天，对照组为8.4±0.3天，差异有统计学意义(P＜0.05)。下肢放置反射出现的时间实验组为10.6±0.7天，对照组为8.1±0.4天，两组有明显的统计学差异(P＜0.01)。实验组出现上肢抓握反射的时间为9.4±0.2天，对照组为7.5±0.2天。实验组下肢抓握反射出现时间为10.4±0.7天，对照组为8.1±0.4天，两组差异都有明显统计学意义(P＜0.01)。实验组完成趋地性反射的日龄为19.0±2.0天，对照组为10.8±0.5天，两组差异有明显的统计学差异(P＜0.01)。对照组大鼠步态反射阳性的日龄是生后10.5±0.5天，实验组为生后13.5±0.3天，实验组步态反射出现的日龄较对照组有延迟，差异有统计学意义(P＜0.05)。⑥生后3周至6周实验组大鼠抓握能力的正常发育趋势缓慢，同日龄实验组大鼠能够抓住网屏的时间较对照组明显减少两组差异比较有明显的统计学意义(P＜0.01)(图16)。实验组大鼠在网格上行走时出现较多的踩空现象。实验组大鼠生后3周到6周前肢步伐失误率及后肢步伐失误率较对照组明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05)。实验组大鼠平衡能力较对照组明显减退。在大鼠生后3周至6周进行平衡木实验，实验组大鼠得分明显高于对照组，差异有明显的统计学意义(P＜0.01)。实验组的大鼠转棒能力增长缓慢，且生后3周至6周实验组大鼠转棒总路程及转棒平均速度较对照组均明显下降(P＜0.05)。⑦水迷宫实验对大鼠游泳曲线、上台成功率、站台周游泳时间比例及游泳平均速度各方面指标进行评价，实验组大鼠青春期、成熟期认知功能较对照组明显降低(P＜0.05)。 结论①3日龄未成熟SD新生大鼠结扎双侧颈总动脉后早期以少突胶质细胞凋亡、弥漫性脑白质损伤为主；脑损伤后期出现脑室扩大和脑白质内软化灶形成。②实验组大鼠幼鼠期出现生长发育障碍，睁眼延迟及眼部发育异常，存在原始神经反射受抑制，甚至惊厥。运动能力在生后2周有一定代偿现象，但随日龄增长出现进行性运动功能缺陷。③在生后3周至6周即儿童期，实验组大鼠运动耐力、伸肌功能、平衡力和运动协调能力下降。④在生后7周至13周即青春期、成熟期阶段，实验组大鼠存在持续的空间认知功能及远期记忆缺陷。⑤本文结果为进一步认识早产儿脑损伤后神经病理和少突胶质细胞超微结构变化与运动、认知行为的关系提供实验依据。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R722.6
【图文】：

(一)分组从复旦大学上海医学院实验动物中心购得清洁级3日龄(P3)SD大鼠30窝，共360只，体重6.5一129，性别不拘。取同窝P3大鼠应用随机数字表随机分为两组:1、正常对照组(假手术组，简称对照组)2、双侧颈总动脉结扎组(简称实验组)(二)造模方法1、将P3SD大鼠用无水乙醚麻醉后，2、无菌条件下作颈腹侧正中切口，取仰卧位，安尔碘皮肤消毒剂消毒颈部皮肤。无菌手术刀切开约o.scm长的切口。3、逐层分离皮下组织，找到血管神经束，分离出双侧颈总动脉。4、对照组缝合皮肤，实验组用9一0丝线完全结扎双侧颈总动脉后缝合皮肤。尔术后在37℃水浴箱内放置10分钟，至体温和活动恢复正常，返笼饲养。(图l)

前后爪放平时记时停止，为大鼠完成翻正反射的时间。6、负向趋地性 (NegativegeotaXis):大鼠头朝下放置在长30厘米倾斜45“的木板中心，记录大鼠转身头向上将四爪放平并能够爬至木板顶端的日龄(图2)。如果

平衡木高40cm，长40cm，宽ICm，两端各有一平台(图3)。大鼠放置在平衡木上，观察120秒。根据大鼠在平衡木上的表现评分，得分越高说明平衡能力越差。平衡木实验评分标准见下(表2)。图3平衡木实验设施表2平衡木实验评分标准实实验表现 现得分分能能够到达平台或能维持正常平衡姿势 势0分 分抓抓住平衡木的一侧 侧1分 分悬悬于平衡木并有一肢体摔下平衡木 木2分 分悬悬于平衡木并有两肢体摔下平衡木或在平平3分 分衡衡木上旋转>60秒 秒4分 分试试图在平衡木上保持平衡>40秒，但摔下 下5分 分试试图在平衡木上保持平衡>20秒，但摔下 下6分 分直直接摔下:无保持平衡意图 图 图4、转棒实验 (Rotarodtest):应用转棒分析系统进行大鼠转棒实验(图4)。转

【引证文献】

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1 刘艳兵;喻云;陈晓;;早产儿脑白质损伤发病机制的研究进展[J];南昌大学学报(医学版);2013年02期

本文编号：2769181