氧化应激介导的自噬与凋亡在尿道下裂发生中的作用及机制

发布时间：2020-07-26 10:36

【摘要】：背景:尿道下裂是儿童最常见的先天畸形之一,高居儿童泌尿生殖系统发育畸形的第二位,国内外相关流行病学调查显示其发病率为1/200~1/300,并呈现逐年上升的趋势。尿道下裂的主要临床表现为阴茎下弯、尿道开口的位置异常,严重影响患儿的身心健康、生活质量,同时患儿成年后的生育能力出现不同程度的降低。尿道下裂发病率高,对患者生存质量影响明显,明显增加了医疗负担。随着中国社会的进步,国内尿道下裂的发病率和发达国家一样,呈现出逐年上升的趋势。目前关于尿道下裂被认为是基因、环境和内分泌等多因素所致的疾病,其具体机制尚不明确。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)属于邻苯二甲酸盐类(PEs)的一员,是我国应用最为广泛的通用型增塑剂,它作为一种典型的环境内分泌污染物能够导致雄性生殖系统的发育异常。DEHP可通过各种途径进入人体,并导致细胞内线粒体产生大量的活性氧簇(ROS)。自噬与合理的凋亡对于哺乳动物的胚胎发育、器官发生发育至关重要,现研究发现氧化应激、自噬、凋亡三者之间具有密切的联系,而它们在尿道下裂的发生过程中所起的作用尚不明确。目的:本实验旨在通过对SD大鼠妊娠期进行DEHP暴露后,探究对子代雄鼠的外生殖发育的影响,以及在子代雄鼠的生殖结节发育过程中氧化应激、自噬、凋亡的变化,进一步探究三者在尿道发育过程中可能的分子调控机制。方法:将20只SPF级SD孕鼠按完全随机法分为2组,其中正常对照组(n=10)采用玉米油干预,1000 mg/kg·d;DEHP暴露组(n=10)采用DEHP染毒,750 mg/kg·d。于GD8.5~18.5时灌胃处理。GD19.5时,麻醉孕鼠后,剖宫取出子代,以有无睾丸来判别子代的雌雄,称重、计数,并在解剖显微镜下进行观察,判别有无尿道下裂的发生,并利用游标卡尺测量雄性子代的肛门生殖器距离(AGD)。收集各组的生殖结节,根据有无尿道下裂的发生分为:正常对照组、DEHP暴露后正常组、尿道下裂组。HE染色、扫描电镜(SEM)观察生殖结节的结构改变;各组生殖结节制成超薄切片后,用透射电镜(TEM)观察其中的自噬水平的改变。提取各组生殖结节的总蛋白,蛋白免疫印迹法(WB)检测各组中相关蛋白:氧化应激相关蛋白(Nrf2、HO-1、SOD1、Gpx)、自噬标记蛋白(p62、LC3、Beclin1)、自噬信号通路蛋白(PI3K、Akt、m TOR、p-Akt Ser473、p-m TORSer2448)以及凋亡相关蛋白(Cleved-Caspase3、Bax、Bcl-2)的表达水平。TUNEL法检测各组生殖结节中细胞的凋亡情况。结果:与正常对照组相比,DEHP暴露组的子代雄鼠中出现尿道下裂的发生率为27.58%(P0.05),并伴有AGD、AGI的减小(P0.05)。在出现尿道下裂症状的生殖结节中,Nrf2-HO1信号通路表达异常,内源性抗氧化物质SOD1、Gpx表达减少(P0.05),且体内的具有抗氧化作用的Vit A、Vit E也异常减少(P0.05);同时其自噬水平异常增高,Akt/m TOR的磷酸化被抑制(P0.05);促凋亡蛋白Bax、凋亡执行蛋白Cleved-Caspase异常增高(P0.05),生殖结节中异常增加的凋亡细胞主要集中在尿道缝及其周围。结论:DEHP进入子代雄鼠体内后,被迅速水解为MEHP,MEHP在细胞内可引起线粒体的呼吸抑制,最终导致过量ROS的产生,使胚胎组织细胞处于氧化应激状态。大量的抗氧化物质,如SOD1、Gpx、Vit A、Vit E等被消耗,活性氧、抗氧化物系统之间的平衡被打破,PI3K/Akt/m TOR通路被抑制,进而引起生殖结节的自噬缺陷。由此,我们推测在氧化应激失衡、自噬缺陷的共同作用下,子代雄鼠的GTs出现异常凋亡,尿道皱褶融合失败,导致了尿道下裂的发生。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R726.9
【图文】：

示意图,融合过程,示意图

10图 1-1.尿道板卷曲、融合过程示意图Fig 1-1. Schematic diagram for the curl and fusion process of urethral plate

示意图,卷管,部位,内分泌干扰物

图 1-2.融合部位卷管化示意图Fig 1-2. Schematic diagram for Canalization of the Urethral 年中，欧美发达国家的尿道下裂发病率增加了一倍[4, 8的趋势[1]。有证据表明，这和环境中的内分泌干扰物（

示意图,示意图,方法

图 2-1 AGD 的测量方法及示意图Fig 2-1. Measuring method and schematic diagram of AGD1.6 GD19.5 GTs 的形态学检查

【参考文献】