TLR4-NLRP3-IL-1β通路在阪崎克罗诺杆菌致坏死性小肠结肠炎中的作用研究

发布时间：2020-07-28 19:08

【摘要】：一、研究背景和研究目的阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii,C.sakazakii)属于革兰阴性肠杆菌,临床上主要引起早产儿和低体重新生儿细菌性脑膜炎和坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC),严重危害新生儿生命安全。C.sakazakii主要通过受污染奶粉以及手术器械进行传播,目前研究多集中于建立新型检测技术,对于其致病机制报道较少。NEC是炎症性疾病,核苷酸寡聚结合域样受体家族(NOD-like receptors,NLRs)参与多种肠道炎症,因此推测C.sakazakii引起NEC与NLRs具有相关性。而 NOD 样受体蛋白 3(NOD like receptor protein 3,NLRP3)是 NLRs中主要作用形式。在机体受到刺激后,NLRP3与半胱氨酸蛋白酶1(Cysteiny1 aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)以及凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)形成三聚体,一方面刺激炎症因子成熟,另一方面促进焦亡相关蛋白gasdermin D(GSDMD)活化,两者共同介导肠道炎症。此外作为机体适应性免疫反应的Toll样受体(TLRs)也与炎症发生密切相关,尤其Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)通过和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)结合介导下游核转录因子κB(Nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells,NF-κB)入核,而 NF-κB 激活,可上调 NLRP3、白介素 1β(Interleukin 1β,IL-1β)和白介素 18(Interleukin 18,IL-18)的表达,从而调控炎症小体。因此炎症小体和TLR4之间存在密切联系,两者可能共同介导炎症的发生。鉴于此,本实验建立C.sakazakii致NEC体内外模型,探讨C.sakazakii致NEC是否通过TLR4介导,激活炎症小体NLRP3,引起细胞焦亡,释放炎症因子IL-1β,从而引发炎症。本研究将为C.sakazakii的致病机制和新的治疗靶点提供研究基础。二、研究方法1.设置C.sakazakii模型组和PBS对照组,采用人结肠癌细胞HT-29以及SD新生大鼠,建立C.sakazakii致NEC体内外模型,使用台盼蓝染色、PI染色、细胞周期检测以及组织病理切片HE染色,明确C.sakazakii的致病性。2.利用Western blot、Q-PCR,对体内外NEC模型中NLRP3相关蛋白及下游炎症因子进行检测,明确炎症小体NLRP3在C.sakazakii致NEC中的作用。3.利用Western blot、免疫组化等对TLR4通路相关蛋白进行检测,探究C.sakazakii致NEC中TLR4和炎症小体NLRP3之间的关系,明确炎症小体NLRP3是否通过TLR4/NF-κB的调控从而介导NEC。三.研究结果1.体外模型结果显示C.sakazakii能够对HT-29细胞造成损伤,与对照组之间存在显著差异,同时细胞周期结果显示其可抑制细胞增殖;体内模型组,肠腔充气明显,肠管明显膨大;HE染色显示模型组肠道组织结构不完整,微绒毛稀薄,出现部分脱落、坏死,病理损伤明显,对照组没有出现明显病理变化。2.WB结果显示体内外模型组,炎症小体NLRP3相关蛋白(NLRP3、ASC、Caspase-1)、下游炎症因子IL-1 β及焦亡蛋白GSDMD-NT表达均上调,与对照组之间具有显著差异;同时体外阻断NLRP3后,阻断组相比模型组,IL-1β mRNA转录水平下调。3.WB和免疫组化结果显示模型组TLR4及下游MyD88的表达量上调,与对照组之间具有显著差异;同时体外阻断TLR4后,阻断组相比模型组Caspase-1蛋白表达和IL-1β mRNA表达下降。四、结论C.sakazakii通过与肠上皮细胞表面TLR4结合,活化MyD88途径,调节下游NF-κBp65入核,激活NLRP3炎症小体,促进IL-1β成熟,诱导GSDMD表达,引起细胞焦亡,导致NEC。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R722.1
【图文】：

细胞损伤,台盼蓝染色,性细胞,中阳

逑行计数，通过分析发现，模型组中阳性细胞数明显高于空白组中阳性细胞数，逡逑两者之间存在显著差异（Ｐ＜0．0５）。见图１－１，１－２。逡逑｜５｜、’逦＇邋＇逦＾逡逑图１－１．台盼蓝染色镜下检测２９５４４对ＨＴ－２９细胞损伤逡逑Ｆｉｇ．１－１．邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆＨＴ－２９邋ｃｅｌｌ邋ｄａｍａｇｅ邋ｂｙ邋ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋Ａ．ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ邋Ｂ．ＮＥＣ逡逑ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑５０－｜逦逦＊逦■逡逑■丨＿逦＿逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦２９５４４逡逑图１－２．台盼蓝染色计数检测２９５４４对ＨＴ－２９细胞损伤逡逑Ｆｉｇ．邋１－２．邋Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆＨＴ－２９邋ｃｅｌｌ邋ｄａｍａｇｅ邋ｃｏｕｎｔｓ邋ｂｙ邋Ｔｒｙｐａｎ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑２．２细胞损伤ｎ染色检测结果逡逑在ｐｉ染色实验中，首先通过白光选定数量差异不大的区域，可以看到空白逡逑组和２９５４４处理组中观察细胞数量没有明显差异。随后我们通过荧光显微镜镜逡逑下观察阳性细胞（红色荧光）数量，可以看到在２９５４４处理组中，阳性细胞数逡逑量明显小于空白组中中阳性细胞数。如图１－３。逡逑１４逡逑

细胞损伤,台盼蓝染色,性细胞

细胞损伤,细胞周期

逡逑＿＿逡逑图１－３．ＰＩ染色检测２９５４４对ＨＴ－２９细胞损伤作用逡逑Ｆｉｇ．１－３．邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｄａｍａｇｅ邋ｔｏ邋ＨＴ－２９邋ｃｅｌｌｓ邋ｂｙ邋ＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ（２００ｘ）邋Ａ，Ｂ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．Ｃ．Ｄ逡逑２９５４４邋ｇｒｏｕｐ逡逑２．３体外损伤细胞周期检测结果逡逑从细胞周期检测结果可以看出，正常组中处于Ｇ１细胞百分比为３２．８５％，逡逑其中处于Ｓ期的细胞数量为４５．０６％，处于Ｇ２期细胞数量为２２．０９％。造模组中逡逑处于Ｇ１细胞百分比为４４．０６％，处于Ｓ期的细胞数量为４２．４９％，处于Ｇ２期细逡逑胞数量为１３．４５％。阪崎克罗诺杆菌主要是阻断细胞的Ｇ１期以及Ｇ２期。如图逡逑１－４。逡逑Ｉ］逦ＩＩ？邋１．邋Ｔ逦屋邋Ｓ逡逑■逦姫蝴逦Ｉ逡逑１：邋Ｉ邋Ｉ；：逡逑＾邋＿逦■逦２２，０９％逡逑：Ｌ－ｗＬ逡逑°逦？逦６０逦Ｓ３逦１００逦0

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