DC固有胆碱能系统和LTB4-BLT2表达及其在JIA炎症反应中的作用研究

发布时间：2020-07-28 20:22

【摘要】： 幼年特发性关节炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是一组由多因素诱导的自身免疫性慢性结缔组织综合症。它涵盖以往的幼年类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，JRA)和幼年慢性关节炎。其并发症和后遗症是儿童后天致残的主要原因之一。其病因至今不明，主要认为是由于感染、遗传、环境、内分泌、神经调节等因素引起机体免疫紊乱而形成反复慢性炎症所致。治疗十分棘手，因此，对其发生机制的探讨和寻找合理有效的治疗途径十分重要。 树突状细胞(dendritic cell，DC)作为专职抗原提呈细胞(antigenpresenting cell，APC)，抗原提呈能力独特，在免疫应答启动、调节和效应等各个环节，均发挥关键性的作用。因此，最近DC在慢性感染、自身免疫病和肿瘤等一系列疾病中所发挥的作用备受重视。 最近研究表明，胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway)是机体重要的抗炎机制之一。免疫细胞如T淋巴细胞和巨噬细胞存在固有胆碱能系统，是胆碱能系统抗炎通路的重要组成部分。免疫细胞胆碱能物质可能是免疫系统与神经系统联系的物质基础，两者吻合的关键分子之一是烟碱样乙酰胆碱能受体(nicotineic acetylcholinergic receptor，nAChR)。该通路出现异常，会导致全身性炎症反应，如引起类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫病的的发生，而刺激小鼠迷走神经可减轻全身炎性反应。最近有学者提出RA可能与迷走神经功能缺陷有关，本实验室前期工作已表明胶原性关节炎与机体的固有胆碱能系统物质表达降低有关。白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)与白三烯B4受体(leukotriene B4 receptor，BLT)信号通路LTB4-BLT(包括LTB4-BLT1和LTB4-BLT2)参与机体的炎症病理反应。它是机体炎症反应的早期“预警信号”(alarm signal)，在机体炎症早期免疫放大中起关键作用。有人提出在RA发病中LTB4-BLT2信号通路可能比LTB4-BLT1发挥更大作用。 树突状细胞(DC)作为抗原提呈功能最强的APC，是否存在固有胆碱能系统和LTB4-BLT信号通路，它们在炎症免疫中发挥怎样的作用?尚无系统研究。因此，探讨DC的固有胆碱能系统，以及与LTB4-BLT信号通路的关系，对于探讨JIA等一类风湿性自身免疫病的炎症机制及其治疗策略可能有重要意义。 本研究旨在探讨DC是否具有胆碱能系统成分(nAChRα7、ChAT和AChE)和LTB4-BLT信号通路物质，以及胆碱能系统和LTB4-BLT2信号通路在JIA炎症反应中的作用。全文分三部分，结果简述如下。 第一部分小鼠骨髓来源树突状细胞的体外诱导培养 目的： DC获取困难。旨在建立小鼠骨髓前体细胞分离培养DC的方法。优化条件，克服影响DC诱导、分化、成熟和消化的相关因素，并在细胞形态、表面标志分子及分泌细胞因子方面予以鉴定。 方法： 1．无菌分离正常BALB／c小鼠骨髓细胞，体外用细胞因子包括重组小鼠白细胞介素-4(interleukin-4，rmIL-4)和重组粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(recombinate mouse granulocyte-colony stimulating factor，rmGM-CSF)诱导、分化为幼稚DC，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激获取成熟DC。 2．光学显微镜观察DC形态变化。 3．采用新鲜配制0.4％胰酶37℃消化细胞。 4．流式细胞术检测DC标志分子。 5．ELISA方法检测幼稚和成熟DC培养上清中白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)含量。 结果： 1．纯化后获取的骨髓细胞与rmIL-4及rmGM-CSF共同培养4h即可看到细胞贴壁，2d可看到少许细胞突起，细胞体积逐渐长大，3d后细胞形状不规则且毛刺状突起增多，逐渐增长，呈幼稚状态DC的形态学改变。培养到6d，加入LPS 24h-48h后，细胞分化程度更高，呈现成熟状态DC的典型树突改变。同时，观察到具有树突形状的细胞数占细胞总数的平均数为85％—90％。 2．DC相对特异标志分子CD_(11)c、主要组织相容性复合分子MHC—Ⅱ、共刺激分子CD80和CD86于DC成熟前后表达率(％)分别为41.783±6.106、32.300±4.586、21.683±2.875、27.523±3.708和75.687±11.671、71.767±9.199、63.293±8.119、71.970±10.485。表明随DC的成熟，其表面标志分子表达明显增多，成熟状态与幼稚状态比较(p＜0.01)。 3．幼稚和成熟DC培养上清中IL-12含量分别为37.7±7.6pg／ml和712±134.425pg／ml，成熟DC培养上清IL-12含量比幼稚DC明显升高(p＜0.01)。 小结： 优化条件建立体外用rmGM-CSF和rmIL-4定向诱导以及LPS刺激小鼠骨髓细胞培养DC的方法。该方法能成功培养出具备幼稚和成熟功能的DC。该方法诱导细胞分化率高、生长稳定、细胞功能完好，是本课题深入研究的技术基础。 第二部分DC固有胆碱能系统和LTB4-BLT信号通路表达 一、成熟DC胆碱能系统表达以及MEC对nAChRα7表达的影响 目的： 探讨成熟DC是否存固有胆碱能系统及其调控机制。 方法： 1．免疫细胞化学方法和免疫荧光抗体技术检测成熟DC胆碱能系统(nAChRα7、ChAT和AChE)蛋白的定位表达。 2．流式细胞术分析成熟DC胆碱能系统(nAChRα7、ChAT和AChE)蛋白的定量表达。 3．RT-PCR方法检测成熟DC胆碱能系统(nAChRα7、ChAT和AChE)mRNA表达。 4．流式细胞仪检测非特异性阻断剂美加明(mecamylamine，MEC)作用于成熟DC 12h对nAChRα7表达的影响。 结果： 1．成熟DC nAChRα7蛋白主要分布于细胞膜，ChAT和AChE主要分布于细胞浆。nAChRα7、ChAT及AChE蛋白表达率(％)分别为41.267±3.470、37.467±4.441和49.867±5.620，三者表达水平比较，AChE表达最强，与ChAT比较(p＜0.05)，与nAChRα7比较有上升趋势。 2．成熟状态DC均有nAChRα7、ChAT和AChE mRNA表达。 3．MEC作用12h后DC nAChRα7表达率(％)为20.651±4.374，MEC能明显抑制nAChRα7表达，与无MEC组比较(p＜0.05)。 小结： 1．成熟DC存在固有胆碱能系统组成成分(nAChRα7、ChAT和AChE)。nAChRα7主要存在于DC细胞膜，而ChAT和AChE主要存在于细胞浆。DC固有胆碱能系统可能与炎症免疫调节功能有关。 2．外源药物(如MEC等)可改变固有胆碱能系统功能状态。 二、DC LTB4-BLT信号通路表达 目的： 探讨DC白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)—白三烯B4受体(leukotriene B4 receptor，BLT)信号通路(LTB4-BLT包括LTB4-BLT1和LTB4-BLT2)存在状态。 方法： 1．ELISA方法检测幼稚、成熟DC培养上清中LTB4含量。 2．免疫细胞化学方法和免疫荧光抗体方法检测成熟DC BLT2蛋白定位表 3．RT-PCR方法检测幼稚和成熟DC BLT mRNA表达。 结果： 1．于2、4和6d(幼稚状态)和8d(LPS刺激后成熟状态)，DC培养上清中LTB4含量分别为10.667±2.394pg／ml、7.089±1.810pg／ml、3.222±0.995pg／ml和14.217±3.396pg／ml，随DC分化进行，其培养上清中LTB4含量呈递减趋势。成熟DC较幼稚DC分泌LTB4含量明显增高(p＜0.05) 2．成熟DC胞膜和胞浆均表达BLT2，以胞桨特别是细胞器表达最强。 3．RT—PCR显示成熟状态和稚状态DC均表达BLT1和BLT2 mRNA，且成熟DC表达水平较幼稚状态DC明显增强(p＜0.05)。 小结： 1．DC可通过分泌LTB4和表达BLT而建立自身LTB4-BLT信号通路。 2．成熟DC LTB4-BLT1和LTB4-BLT2信号通路表达较幼稚DC增强，成熟DC胞膜和胞浆均表达BLT2，以胞桨特别是细胞器表达最强。该信号通路可能参与了DC分化、成熟过程。 3．DC可能通过上述LTB4-BLT1和LTB4-BLT2两条信号通路在炎症反应中发挥重要作用。 第三部分DC固有胆碱能系统和LTB4-BLT2信号通路在JIA炎症反应中的作用 目的： 探讨DC固有胆碱能系统和LTB4-BLT2信号通路在JIA炎症反应中的作用。 方法： 1．流式细胞仪检测正常血清组、JIA活动期血清组和JIA活动期血清+美加明(MEC)组对DC nAChRα7、BLT2表达的影响； 2．ELISA方法检测正常血清组、JIA活动期血清组和JIA活动期血清+MEC组作用DC 18h前后，培养上清中IL-12和LTB4含量； 3．流式细胞术检测正常血清刺激的DC条件培养液组、JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组、MEC干预的JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组对小鼠脾淋巴细胞活化(CD69表达)的影响； 4．MTT法检测正常血清刺激的DC条件培养液组、JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组、MEC干预的JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响； 结果 1．正常血清组、JIA活动期血清组和JIA活动期血清+美加明(MEC)组作用成熟DC 18h后DC nAChRα7表达率(％)分别为：39.80±4.12、52.66±7.99和45.49±7.73。JIA活动期血清组与正常血清组比较，nAChRα7表达明显增强(p＜0.05)，而美加明(MEC)作用后，nAChRα7表达下调。 2．正常血清组、JIA活动期血清组和JIA活动期血清+美加明(MEC)组作用成熟DC 18h后BLT2表达率(％)分别为：27.57±2.989，45.947±8.068和67.343±11.394。JIA活动期血清组与正常血清组比较，BLT2表达增强(p＜0.05)；MEC作用后，BLT2表达更显著(p＜0.01)。 3．正常血清组、JIA活动期血清组、JIA活动期血清+MEC组分别作用DC 18h前后，DC培养上清中IL-12、LTB4含量与DC作用前，检测实际为血清中细胞因子的含量。 1)与DC作用前，JIA活动期血清组和正常血清组IL-12含量分别为975.525±206.638pg／ml和23.823±3.555pg／ml，JIA活动期血清组比正常血清组IL-12含量明显增高(p＜0.01)；培养18h后，正常血清组、JIA活动期血清组和JIA活动期血清+MEC组IL-12含量分别为48.893±9.562pg／ml、1281.175±228.586pg／ml、1618.075±292.81pg／ml，与正常血清组比较增高明显(p＜0.01)。而JIA活动期血清组+MEC组比JIA活动期血清组IL-12含量亦有升高(p＜0.05)；同时，JIA活动期血清组IL-12表达量在DC作用后比作用前亦增强(p＜0.05)。 2) JIA活动期血清组和正常血清组LTB4含量分别为82.375±19.9pg／ml和16.9±2.953pg／ml，JIA活动期血清组与正常血清组比较明显增高(p＜0.01)；18h后，正常血清组、JIA活动期血清组和JIA活动期血清+MEC组LTB4含量分别为24.225±6.264pg／ml、114.575±20.375pg／ml和142.05±24.574pg／ml。JIA活动期血清组、JIA活动期血清+MEC组LTB4表达量比正常血清组增高明显(p＜0.01)。同时，JIA活动期血清+MEC组LTB4含量比JIA活动期血清组亦增高(p＜0.05)；JIA活动期血清组与作用18h前比较，LTB4含量的增高亦有差异性(p＜0.05)。 4．正常血清刺激的DC条件培养液组、JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组、MEC干预的JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组联合小剂量刀豆蛋白(Concanvalin A ConA)体外刺激淋巴细胞8h，CD69表达率(％)分别为：3.4±0.683、34.35±5.17、43.35±7.12。JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组、MEC干预的JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组比正常血清刺激的DC条件培养液组CD69表达水平显著增高(p＜0.01)。同时，MEC干预的JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组与无MEC干预的JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组比较，CD69亦增高(p＜0.05)。 5．正常血清刺激的DC条件培养液组、JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组、MEC干预的JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组联合小剂量ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖结果(SI值)分别是：1.979±0.307、3.053±0.432、3.672±0.817。MEC干预的JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组增殖作用最强，与JIA活动期血清刺激的DC条件培养液组比较(p＜0.05)。与正常血清刺激的DC条件培养液组比较增殖作用显著(p＜0.01)。 小结： 1．JIA活动期血清能刺激DC，使nAChRα7和BLT2表达上调，MEC则下调nAChRα7表达，抑制胆碱能系统的抗炎作用。 2．DC固有胆碱能系统功能抑制，可引起LTB4-BLT2信号通路活化，加强炎症反应。 3．DC胆碱能系统功能抑制，可促进IL-12和LTB4等炎性因子分泌而增强炎症反应。 DC固有胆碱能系统调节紊乱以及LTB4-BLT2信号通路活化所致的炎症放大反应和免疫细胞过渡活化可能参与了JIA的炎症病理过程。 总结 1．DC存在固有胆碱能系统成分(nAChRα7、ChAT和AChE)以及LTB4-BLT信号通路。 2．JIA活动期血清能增强DC nAChRα7和LTB4-BLT2表达，MEC能抑制nAChRα7表达，增强LTB4-BLT2表达，并引起DC致炎因子(LTB4，IL-12)分泌升高。提示：DC固有胆碱能系统功能失调和LTB4-BLT2信号通路活化可能参与了JIA炎症病理过程。 3．JIA活动期血清刺激的DC条件培养液明显促进淋巴细胞活化(CD69表达)、增殖。MEC干预后，上述作用更显著。提示：DC及其固有胆碱能系统参与了淋巴细胞的增殖活化调控，该作用失调，会造成免疫细胞的异常活化。 结论：DC胆碱能系统功能抑制和LTB4-BLT2信号通路活化可能参与了JIA发病的炎症过程。通过激活DC胆碱能系统和阻断LTB4-BLT2信号通路可能是控制JIA等自身免疫病的有效途径。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R725.9
【图文】：

华中科技大学同济医学院博士研究生毕业论文图1一loc形态学改变树突形状的幼稚DC(6d)(xZOO)图1一Zoc形态学改变典型树突形状的成熟DC(8d)(xZOO)二、流式细胞仪分析DC表面标志分子CDI:e、MHC一11及CD80、CD86表达DC相对特异标志分子CD，，c、组织相容性复合分子MHC一n、共刺激分子CD80(B7一1)和CD86(B7一2)随DC(P(0.01)。(表1一1和图1一3，的成熟表达明显增多，成熟状态与幼稚状态比较1一4)。表1一1幼稚和成熟 DCCDlle、MHC一11、CD80和CD86表达百分数(%)(x士s，n=3)表型分子幼稚DC成熟DC CDllC41.783士6.10675.687土 11.671*申MHC一11767士9.199.今…电‘上Q口11

本文编号：2773398