人α-半乳糖苷酶A突变体的构建、表达及生化性质的初步研究

发布时间：2020-07-28 21:28

【摘要】：法布莱氏病(Fabry disease),是一种罕见的X染色体连锁遗传的鞘糖脂类代谢疾病,由定位于Xq22的α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A,GLA或α-Gal A)基因突变造成[1]。α-半乳糖苷酶A(α-galactosidase A,GLA)的缺失可导致其底物球形三脂酰基鞘鞍醇(Gb3)和糖苷神经鞘脂类在全身细胞、组织和器官中累积,引起血液循环障碍并进一步导致心、肾功能衰竭和神经系统紊乱而死亡[2]。法布莱氏病的发病率为1/4000~1/11700[3],大多在儿童和青少年时期发作,若不及时治疗,一般在40岁左右就会死亡。酶替代疗法是目前治疗法布莱氏病最有效的方法[4]。而获得足量、高活性的GLA是进行酶替代疗法的关键。由于GLA是一种糖蛋白,糖基化对其功能的影响至关重要,而哺乳动物细胞表达系统的糖基化修饰功能与人类相同,是表达GLA系统的首选体系,但存在表达量低的缺陷。这成为本实验的一个制约因素。据文献报道[5],mRNA5’非翻译区和编码区的核苷酸序列的改变,能有效的提高其翻译效率。据此,我们拟通过改变GLA mRNA编码区的核苷酸序列来提高蛋白的表达效率。首先,构建含野生型和突变型GLA基因的真核表达载体并转染哺乳动物细胞,筛选获得高表达GLA的单克隆细胞。其次,优化GLA蛋白诱导表达的条件,大规模培养高表达GLA的宿主细胞。再次,建立GLA分离、纯化的方法,获得高纯度的GLA。最后,对重组GLA的理化性质及生化特性进行初步分析。主要研究内容及研究结果有: 1.重组质粒的构建通过RT-PCR方法从SMMC-7721细胞中克隆cDNA。设计引物,扩增野生型GLA基因及突变型GLA基因(起始密码子后的第一个碱基由胞嘧啶突变为鸟嘌呤)。将扩增的基因连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A质粒(在C末端含有6×His标签,这方便后续的纯化;含有新霉素(neomycin)基因,易于对阳性克隆的筛选)上。经酶切鉴定及测序分别证实我们获得了含野生型和突变型GLA基因的重组质粒,并将其命名为pcDNA3.1/myc-His A-GLA和pcDNA3.1/myc-His A-mutation-GLA。 2.阳性克隆的筛选及诱导条件的优化将构建的重组质粒分别转染CHO细胞和HEK293细胞,经用G418筛选获得4种抗性克隆。检测各种克隆表达的GLA活性,从每种克隆中各选择一株GLA活性最高单克隆细胞,将转染野生型和突变型GLA基因的CHO细胞分别命名为CHO(GLA)和CHO(m-GLA),转染野生型和突变型GLA基因的HEK293细胞分别命名为HEK293(GLA)和HEK293(m-GLA)。将这4株单克隆细胞以相同的条件培养,并加丁酸钠诱导72h,检测培养上清分泌的蛋白活性,发现CHO(GLA)、CHO(m-GLA)、HEK293(GLA)和HEK293(m-GLA)培养上清的GLA蛋白活性分别为:8.3×10~6、14.2×10~6、0.5×10~6和1.4×10~6U/L。可见,对于同种宿主细胞,转染含突变型GLA基因质粒的细胞比转染含野生型GLA基因质粒的细胞培养上清的GLA活性明显要高;而且转染同种质粒后,对CHO细胞来说,表达蛋白的活性也明显高于HEK293细胞。随后我们对CHO(GLA)和CHO(m-GLA)细胞密度、诱导剂量及诱导时间等条件进行优化,得出在6孔板中每孔培养50万个细胞效果最好,细胞密度过高,空间不足;密度过低,蛋白表达量不高。对于丁酸钠剂量,诱导剂量较低时,表达量则很低,剂量升高时蛋白表达量也随之升高,当浓度高于10mmol/L时,蛋白表达量没有明显升高。随着诱导时间的延长,蛋白表达量会升高,在60h左右达到最高值,若时间过长,一方面,细胞会死亡;另一方面,表达的蛋白易于失活。所以我们选择60h作为最佳诱导时间。 3.表达产物的鉴定扩大培养CHO(GLA)和CHO(m-GLA)细胞,10mmol/L丁酸钠诱导60h后,收集培养上清,并用HisTrap~(TM) FF柱纯化。纯化后的样品经SDS-PAGE分析,发现在50kd附近有清晰的条带,与GLA相符,提示纯化产物可能是重组的GLA蛋白。经灰度扫描,纯度分别为95.2%(野生型GLA)和95.8%(突变型GLA),说明产物纯度较高。由于构建的载体在C末端含有6×His标签,我们接着对纯化的样品分别用抗GLA和抗6×His的抗体进行蛋白免疫印迹分析,发现两种抗体均可在50kd附近检测到明显的信号,进一步表明纯化产物为重组GLA蛋白。对纯化前后蛋白比活性的比较发现,在纯化前突变型和野生型GLA比活性分别为0.0029×10~6和0.0316×10~6U/mg;纯化之后的野生型GLA的比活性(0.69×10~6U/mg)与商品化的GLA(0.77×10~6U/mg)相当,而突变型GLA的比活性(1.78×10~6U/mg)则是商品化的GLA的2.3倍,提示突变型GLA的蛋白活性是野生型的2-3倍。由于纯化前突变型GLA的比活性大约是野生型GLA的10倍,提示基因突变除了能够显著增加GLA蛋白活性外,还能提高mRNA的翻译效率。 4.GLA生化性质的研究对纯化后的样品,我们测定其相对分子量、最适反应pH、最适反应温度及酶反应动力学参数Km和Vmax等生化性质。通过质谱分析,野生型和突变型GLA分子量分别是54.9×10~3和54.8×10~3,略大于推算的分子量,这可能是由GLA糖基化引起的。其最适反应pH在4.6附近,与标准品相似。两者最适反应温度随着温度的升高逐渐增强,在37℃时达到最大,这点也与标准品相似,但标准品在较低温度时酶的活性比我们表达的两种GLA活性略高。通过对米氏常数和最大反应速度的研究,我们发现野生型GLA的Km为2.39μmol/L, Vmax为0.0034μmol/min;突变型GLA的Km为1.27μmol/L, Vmax为0.0036μmol/min;标准品Km为3.45μmol/L, Vmax为0.0045μmol/min。提示突变型GLA对底物的亲和力最高,标准品对底物的亲和力最低,但标准品比其他两者的Vmax要略高,这也解释了突变型GLA比野生型GLA的比活高的原因。以上结果表明,我们通过定点突变的方法构建了含突变型GLA基因的重组质粒,并且转染CHO细胞和HEK293细胞,获得表达高活性GLA的单克隆细胞,其中转染突变型GLA基因的CHO细胞[CHO(m-GLA)]的GLA表达水平最高。我们优化了单克隆细胞诱导表达条件并进行大规模培养,发现CHO(m-GLA)细胞培养上清的GLA比活性是CHO(GLA)细胞的10倍。收集并纯化培养上清,SDS-PAGE和蛋白免疫印迹鉴定,证实通过一步亲和层析即可获得较高纯度的GLA蛋白。对纯化产品的活性及理化性质分析结果显示,突变型GLA蛋白的主要生化性质没有发生改变,但对底物的亲和力及活性明显提高,推断突变不仅可以增加GLA mRNA的翻译水平,而且可引起蛋白空间结构的改变,从而提高GLA的活性。总之,我们获得了高表达突变型GLA的CHO细胞株,并且重组GLA高纯度、高活性,为下一步生产重组GLA并最终用于法布莱氏病的治疗奠定了坚实的基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R725.9
【图文】：

基因扩增,突变型,野生型,PCR扩增产物

进行 PCR 扩增，通过 1%琼脂糖凝胶电泳分析，得到了预期大小为 1300kb左右的产物(图 1-1)。图1-1 人GLAcDNA的PCR扩增产物A.野生型GLA基因扩增；B.突变型GLA基因扩增；M. DNA标志物 DL2000；1~2. PCR扩增目的片段1.3.2 人 GLA 重组质粒的构建用 EcoRⅠ、XholⅠ分别对两种 PCR 产物及 pcDNA3.1/myc-His A 质粒进行50003000200010007505002501005000300020001000750500250100A bp M 1 2 Bbp M 1 2

真核表达质粒,重组质粒,突变型,连接酶

第一部分重组质粒的构建收目的基因片段和表达载体基因，并用 T4 连接酶将其连接， 1-2)。将重组质粒转化 DH5α 感受态细胞，筛选阳性菌落，摇经 EcoRⅠ、XholⅠ双酶切，在重组质粒上均可获得 1300kb 左测序结果表明两个重组质粒分别含有野生型和突变型的 GLA-4)，分别命名为 pcDNA3.1/myc-His A-GLA 和 pcDNA3.1-GLA。

标志物,酶切鉴定,重组质粒,产物

图 1-4(A) 野生型 GLA 基因测序图谱bpM 1 2 3图1-3 重组质粒的酶切鉴定M. DNA 标志物 DL2000；1.pcDNA3.1/myc-His A-GLA质粒酶切产物;2.pcDNA3.1/myc-His A-mutation-GLA质粒酶切产物;3.空载体酶切产物.

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