肠道病毒71型手足口病血清学ELISA诊断试剂盒制备和初步评价

发布时间：2020-08-09 22:37

【摘要】： 目的研制早期快速检测抗肠道病毒71型(EV71)抗体的ELISA血清学诊断性试剂盒,评价其临床应用价值。方法将表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原,建立EV71型手足口病间接ELISA法的血清学检测方法。通过与逆转录(RT)PCR方法、EV71病毒分离试验和微量血清中和试验比较,评价抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清学诊断方法在EV71型手足口病的诊断价值,并进行临床考评。结果与RT-PCR比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83%,85%,81%和87%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72%,74%,68%和77%。与EV71病毒分离方法比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度分别为85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度分别为75%和77%。通过直线相关分析发现,抗-EV71 IgG抗体滴度和中和抗体滴度呈显著正相关(r =0.72,P0.001)。EV71型手足口病患儿恢复期血清抗IgG滴度较急性期升高(P0.001),但抗IgM滴度差异无统计学意义(P=0.287)。重复试验变异系数小于10%。临床100份样本检测,抗EV71IgM抗体灵敏度与特异度均超过85%。试剂放置4周后,检测结果稳定。结论利用VP1重组蛋白作为包被抗原,成功开发ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R725.1
【图文】：

细胞,病毒,细胞发生,抗体

检测抗 EV71 EV71IgM,IgG 抗体手足口病 EV71 抗体诊断性试剂盒V71 流行病学调查，EV71 阳性患者愈后抗体持续水平研究离及鉴定染细胞后，大多能引起细胞病变（cytopathic effect，CPE），、坏死、破碎或脱落，EV71的CPE现象无需染色便可直接在观察，记录时+代表25%以下细胞发生病变，++代表50%左右+代表75%左右，++++代表100%左右细胞发生病变。图1显示所出现的CPE现象。某些病毒在初次接种后便出现明显CPE，续3－4次传代后才能出现，若超过5代仍没有出现CPE，则证败，或者样本中根本就没有所要分离的病毒。

病毒分离培养,B细胞,细胞,荧光

结果细胞（CPE）的细胞（图 2）制备抗原片，加入用间接免疫荧光法镜检病毒。荧光显微镜下观察荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内荧光为阴性。（图 2C）

电泳图,肠道病毒,电泳图

17图3 肠道病毒（EV71、CA16）RT-PCR电泳图注：A 图为肠道病毒EV71电泳图 B 图为肠道病毒CA16电泳图A1 阳性条带 A2 阴性条带 A3 阳性对照 A4 阴性对照 AM Marker DL100B1 阴性对照 B2 阳性对照 B3 阴性条带 B4 阳性条带 BM Marker DL20003.3 表达重组VP1蛋白3.3.1 VP1基因的扩增和重组pET-21b(+)-VP1阳性质粒的鉴定提取EV71 流行株的病毒RNA作为PCR扩增模板进行RT-PCR，电泳结果显示可以扩增出891bp左右特异的V P1基因片段(图1A)。pET-21b:VP1阳性重组质粒分别经EcoR I和Hind III进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分别见到约891bp和5.5kb两条片段(图1B)。以重组阳性质粒为模板，利用PCR扩增出大小约891bp的特异性片段(图1C)。重组质粒pET-21b:VP1经测序，确定重组质粒pET-21b:VP1中正确插入VP1基因，表明重组质粒pET-21b:VP1构建成功。3.3.2 VP1重组蛋白的表达、纯化与鉴定表达的重组菌裂解液经12％SDS-PAGE电泳分离，Coomassie blue 染色后，在约35kD处出现一条明显的蛋白条带(见图4A)

【参考文献】