细菌革兰双检荧光定量PCR技术的建立及临床应用

发布时间：2020-08-23 10:59

【摘要】： 败血症(sepsis)是一种严重的细菌性感染疾病,在新生儿中具有较高的死亡率,发病隐匿,临床症状无特异性。因此,寻找一种快速、准确的败血症早期诊断方法,对指导临床治疗、降低患儿死亡率、改善预后,具有十分重要的意义。目前,细菌培养是作为“金标准”在诊断临床细菌性病原微生物标本,然而该方法缺乏快速和敏感性。在本研究中,我们分析细菌16s rRNA基因序列,在其保守区设计通用引物和革兰阴、阳性菌分型探针,建立了细菌革兰双检荧光定量PCR新方法,并对临床的相关标本进行了检测。本研究分二部分:第一部分,细菌革兰双检荧光定量PCR技术的建立;第二部分,细菌革兰双检荧光定量PCR技术临床应用。 第一部分细菌革兰双检荧光定量PCR技术的建立 方法: 分析临床常见菌16S rRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和革兰阳性和阴性分型探针,建立细菌革兰阴、阳性菌双通道荧光定量PCR检测体系,选取临床较常见的53株临床分离株(25株为革兰阳性菌、28株为革兰阴性菌)进行细菌革兰双检荧光定量PCR方法检测,以评价该方法探针的特异性;以金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌分别代表革兰阳性和阴性菌进行浓度梯度稀释,稀释品进行该方法的检测以评价细菌革兰双检荧光定量PCR的敏感度和线性关系。 结果: 细菌革兰双检荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,最低能检测到3个金黄色葡萄球菌,而大肠杆菌可以检测低到1个细菌数。53株临床培养分离株进行该方法检测:25株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针(FAM-G~+探针)检测均为阳性,28株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针(VIC-G~-探针)检测均为阳性,反之均为阴性,符合率100%。巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒,新型隐球菌及白色念珠菌,人基因组DNA及空白对照均为阴性。 结论: 建立了用通用弓J物和分型双荧光探针的细菌革兰双检荧光定量PCR方法。其检测快速、准确,具有较大的临床推广应用和临床指导用药价值。 第二部分细菌革兰双检荧光定量PCR技术临床应用 方法: 用建立的细菌革兰双检荧光定量PCR方法对1000例临床疑似为败血症的患儿血标本和125份拟诊为化脓性脑膜炎的脑脊液标本,进行该方法的检测,同时进行细菌培养对照实验,检测结果进行统计学分析。 结果: 1.在1000例血标本中,细菌革兰双检荧光定量PCR共检出64例阳性标本,其中革兰阳性菌40例,革兰阴性菌24例,阳性率为6.40%(64/1000);血培养共检出50例阳性,阳性率为5.00%(50/1000),阳性率前者高于后者,差异有统计学意义(P＜0.01)。 2.在125份脑脊液标本中,细菌革兰双检荧光定量PCR共检出17份阳性,其中革兰阳性菌为10份,革兰阴性菌为7份,阳性率为13.6%(17/125);脑脊液细菌培养共检出6份阳性,阳性率为4.8%(6/125);阳性率前者显著高于后者,差异有统计学意义(P＜0.01)。 3.以细菌培养为对照,对血标本和脑脊液标本进行汇总,细菌革兰双检荧光定量PCR的检测敏感度为91.07%,特异性为97.36%,约登指数为0.8843,检测符合率为97.05%,kappa值0.89。 结论: 建立的细菌革兰双检荧光定量PCR技术新方法用于临床标本(包括血、脑脊液)的检测,具有快速、特异、敏感的特点,可为临床早期、准确诊断败血症和化脑等细菌性感染疾病提供新方法。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R725.1
【图文】：

与此同时该28株革兰阴性菌在FAM通道(FAM一G十探针)均为阴性(表l)。人巨细胞病毒、EB病毒、乙肝病毒，新型隐球菌、白色念珠菌、人基因组DNA以及空白对照等检测结果均为阴性(图2.1，2.2，2.3)凿凿忿辉盟黔哩望矍罐寒耀哪檬辫群擎卿豁瞬麟麒姗瀚 !!!队 队M一G一通i笆一一卡 卡一 一‘人~一一一一一一一‘痴高‘‘‘盆一____山一一一一一 一图2.1表皮葡萄球菌革兰双检荧光定量图{TI，:二沪钾尸，、.，，，1.

空白对照组革兰双检荧光定量图

对上述构建的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌 165rRNA基因重组质粒进行测序验证，经与基因库中相应细菌序列比较，其同源性均大于98%(部分测序图见图2.4，2.5)。分别取该重组质粒经紫外分光广度计初步定量后的浓度梯度标准品loo/ul一ros/ul进行细菌革兰双检荧光定量PcR，结果发现革兰阳性菌探针对金黄色葡萄球菌的重组质粒从10’/ul一1护/ul具有良好的线性关系，而革兰阴性菌探针对大肠埃希菌的重组质粒从100/ul一105/ul均具有良好的线性关系(图2.6，2.7)o1001101201301叨1501‘01，0图2.4金黄色葡萄球菌部分序列分析图100C人GC人C1101201301401501601，0ll

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 吴仕孝;新生儿颅内感染[J];实用儿科临床杂志;2005年02期

2 郑季彦,尚世强,吴亦栋,徐亚萍,杜立中;16S rRNA基因芯片诊断新生儿败血症[J];中华传染病杂志;2005年03期

3 余加林,吴仕孝,贾慧群,母灿荣,范永萃;新生儿感染病原菌及药敏试验12年总结[J];中华儿科杂志;2001年06期

4 尚世强,董关萍,付君芬,洪文谰,杜立中,俞锡林;细菌16S-23S rRNA基因特异DNA图谱的分子诊断[J];中华儿科杂志;2003年09期

5 中华医学会儿科学分会新生儿学组 ,余加林,吴仕孝;新生儿败血症诊疗方案[J];中华儿科杂志;2003年12期

6 童美琴,尚世强,吴亦栋,赵正言;16SrRNA基因PCR加基因芯片杂交快速诊断新生儿败血症[J];中华儿科杂志;2004年09期

7 吴亦栋;尚世强;李建平;杨祖钦;郑之北;杜立中;赵正言;;细菌16SrRNA基因荧光定量PCR诊断新生儿败血症[J];中华儿科杂志;2007年06期

8 王荣山,吴亦栋,尚世强,杨祖卿,杜立中;实时荧光定量PCR检测细菌方法的建立及其临床应用[J];中华围产医学杂志;2005年04期

9 闫志勇,王斌,苏维奇,毕春霞,钱冬萌,宋卫青;多重半套式聚合酶链反应检测脑脊液中细菌16SrRNA基因[J];中华微生物学和免疫学杂志;2001年04期

10 尚世强,洪文澜,俞惠民,孙眉月,滕恣群,金益人;细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型[J];中华医学检验杂志;1998年05期

本文编号：2801441