高通量测序及代谢组学分析对母乳性黄疸患儿肠道菌群结构与功能的研究

发布时间：2020-09-23 08:10

　　第一部分通过高通量测序的方法探讨母乳性黄疸患儿肠道微生物群的特征及功能目的:通过高通量测序探讨母乳性黄疸婴幼儿肠道微生物群的特征及功能。方法:收集并选取2015年10月至2016年3月遵义市第一人民医院新生儿科和产科共34例婴幼儿为研究对象,分为母乳性黄疸(BMJ)病例组(16例)和母乳喂养未有黄疸对照组(18例),提取粪便DNA并通过PCR扩增和1%琼脂糖凝胶电泳分析,然后用Mi Seq系统测序。采用相对生物信息学方法分析DNA测序数据,利用Illumina高通量测序平台分析婴儿粪便样品中的16S r DNA V3和V4片段进行相关生物信息学分析。结果:母乳性黄疸患儿与母乳喂养未发生黄疸婴幼儿的菌群相比,大便中的肠道菌群在属水平链球菌属比对照组显著增多,肠球菌属比对照组显著减少(P0.05);物种差异分析结果显示在门水平两组大便中变形菌门、厚壁菌门、放线菌及拟杆菌均没有统计学差异;母乳性黄疸患儿肠道菌群的多样性与对照组菌群多样性相比,两组没有统计学差异(P0.05);16S功能预测结果显示在lever3水平,青霉素和头孢菌素生物合成代谢通路差别有统计学意义,在母乳性黄疸组中青霉素和头孢菌素的生物合成增多(P0.05)。结论:母乳性黄疸婴儿肠道微生物组中链球菌属比例显着增多,而肠球菌属比例显著减少,这提示母乳喂养婴儿肠道中的链球菌和肠球菌对于降低母乳性黄疸的发生是有重要作用的。第二部分:代谢组学的方法分析母乳性黄疸的肠道菌群特点目的:代谢组学方法分析母乳性黄疸患儿肠道菌群的差异代谢物,以期找到与母乳性黄疸相关的生物标记物。方法:收集并选取2015年10月至2017年4月遵义市第一人民医院新生儿科和产科共65例婴幼儿为研究对象,分为母乳性黄疸病例组(30例)和母乳喂养未发生黄疸对照组(35例),利用气相色谱仪-质谱仪(Gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)对细菌的代谢产物进行靶向测定短链脂肪酸分析研究。结果:共有65例粪便标本纳入研究,分析发现乙酸在母乳性黄疸(BMJ)组中含量低于对照组(734.4±95.41ug/g vs 1148±134.5ug/g),两组比较有统计学差异(t=2.56,P0.05);丙酸在BMJ组中含量低于对照组【46.81(44.26,56.06)ug/g vs 53.13(45.1,127.41)ug/g】,两组比较差异有统计学意义(F=-2.12,P0.05)。结论:母乳性黄疸婴儿肠道菌群代谢物中乙酸和丙酸(短链脂肪酸)显著减少,提示母乳喂养婴儿代谢产物中的乙酸和丙酸与母乳性黄疸的发生有着重要的关系,同时肠道菌群组成分析结果与代谢组学分析结果有着良好的联系,为多组学深入研究BMJ的发病机制提供可能。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R722.17
【部分图文】：

流程图,生物信息学分析,流程图

重庆医科大学博士研究生学位论文可根据不同的相似度水平，对所有序列进行 OTU 划分，通常在 97%的相似水平下的 OTU 进行分类学分析，并分别在各个分类水平：域（domain），界（kingdom），门（phylum），纲（class），目（order），科（family），属（genus），种（species）统计各样本的群落组成；根据 OTU 聚类分析结果，对测序深度进行检测同时进行物种多样性分析；根据 OTU 分布情况，比较不同分组间 OTU 组成重叠及差异情况。综上所述，在得到序列基础上进行系列关于物种多样性及群落结构的生物信息学及统计学分析。

物种,变化趋势,序列数,样本量

选取收集 34 例，粪便细菌 DNA 进行高通量上机测序，其中 BMJ 组 16 例，对照组 18 例，所有样本经 Illumina Miseq 平台测序序列优化后，共获得序列数1,176,681 条，每份样本平均序列数为 15135 条。测序深度均达到 99.66%以上。统计各样本 OTU 聚类情况和对应物种分类学谱系，按最小样本序列数进行样本抽平，得到从域、界、门、纲、目、科、属、种以及 OUT 个数分别为：Domain:1、Kingdom:1、Phylum:40、Class:82、Order:169、Family:300、Genus:466、Species:779以及 OTU:1215。2.2.2 Pan／Core 物种分析由图 1.3 的 Pan／Core 物种分析图可知，随着样本量的加大，物种总量在增多，成正比，上升趋势；而随着样本量的增多核心物种量在变少，成反比，下降趋势的变化情况。

菌群,多样性指数,标本,指数

B12 25 1.199079 0.438848 45.094986 39 0.999503B13 312 3.489026 0.132981 320.199837 337.090909 0.998508B14 30 0.973868 0.476624 47.641152 43 0.999129B15 208 1.888897 0.210897 557.647404 388.025641 0.9926B16 352 1.949541 0.281388 545.23686 507.081081 0.990548基于上表的基础数据对 Shannon 和 Ace 指数进行组间差异检验分析，由图 1.4可知，Shannon 指数 BMJ 组高于对照组，进步统计学分析得出 BMJ 组的 Shannon指数：1.38±0.79，对照组：1.17±0.64，两组比较无统计学意义（P＞0.05）；Ace指数 BMJ 组高于对照组，统计学分析得出 BMJ 组的 Ace 指数：229.81±176.62，对照组：258.06±186.91，两组比较无统计学意义（P＞0.05），说明 BMJ 组患儿粪便标本肠道菌群多样性和丰富度没有明显变化（见图 1.4）。P＞0.05P＞0.05

【参考文献】