人巨细胞病毒感染与心肌损害关系的研究

发布时间：2020-09-29 08:07

　　目的探讨人巨细胞病毒在与心肌细胞损害之间的关系,为临床病毒性心肌炎病原学研究和诊断提供理论依据。方法本实验分体外及体内两部分:(一)体外部分:第一部分是SD大鼠原代心肌细胞培养。取出生1-3天的SD大鼠15只,无菌取其心室肌用0.25%胰蛋白酶消化后制成心肌单细胞悬液,移入培养瓶进行培养。第二部分是用HCMV病毒感染新生的SD大鼠的培养心肌细胞。取长成单层的乳鼠心肌细胞,分成二组:○1细胞对照组○2病毒感染组。在病毒感染组细胞中每孔加0.5ml含100TCID50HCMV的生长液,对照组仅加入等量的生长液。37℃温育2h后,各组弃上清液,加生长液1ml/孔,置37℃5%CO2培养箱中培养,待病毒对照组CPE(++++)时,停止培养,观察感染后的细胞病变、搏动情况,取各组细胞培养液上清,检测培养液中心肌谷草转氨酶(AST)乳酸脱氢酶(LDH),肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及肌钙蛋白(cTnI)水平的改变并通过形态学鉴定HCMV在心肌细胞内感染状况。(二)体内部分:以HCMV诱导BALB/C小鼠心肌炎模型。将30只小鼠分为A、B、C三组,每组10只。其中A组为HCMV感染组,腹腔注射HCMV AD169株悬液0.5ml/只;B组为HF对照组,腹腔注射HF悬液0.5ml/只;C组为DMEM对照组,腹腔注射DMEM悬液0.5ml/只。分别与注射后第20天取血、心肌标本,进行心肌病毒分离及病理和电镜检测。结果体外部分:培养的SD新生乳鼠心肌细胞感染HCMV后,细胞逐步出现病变,细胞停止搏动,在第5天及第7天的培养液中AST、LDH、CK、CK-MB、cTnI均明显高于细胞对照组(p0.05),同时HCMV pp65蛋白免疫荧光及免疫组化等检测亦为阳性。体内部分:HCMV感染小鼠心肌炎总发病率为80.0%,感染组分别在病毒感染后的第5～10天各死亡一只,死亡率为20.0%。HCMV感染后的第5-20天,病理HE染色可见心肌细胞出现肿胀、变性、血管周围可见有大量的炎性细胞浸润,电镜下心肌细胞内可见有巨细胞病毒颗粒。结论1、HCMV AD169株使体外心肌细胞形态学及酶学发生了改变,体内心肌细胞发生炎症反应,说明HCMV可能具有感染鼠心肌细胞的能力。2、HCMV可能是病毒性心肌炎的重要病原体之一。在临床治疗小儿病毒性心肌炎时,应结合病原学检测,考虑针对HCMV的抗病毒治疗。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R725.4
【部分图文】：

形态图,心肌细胞,形态,完全停止

16图 1 正常乳鼠心肌细胞的形态（×400）将 HCMV AD169 株细胞悬液接种在心肌细胞后的 2-3 天内,细胞搏动变慢且不规则,CPE 不明显；在接种后的第 4 天，心肌细胞搏动明显减少，部分细胞已完全停止搏动。细胞胞浆中出现大量的空泡，折光性减弱,部分细胞出现了团缩，如图 2 所示

形态图,形态,心肌酶,病毒株

图 2 HCMV 感染乳鼠心肌细胞的形态（×400）3.1.2 HCMV 病毒的感染力（TCID50）实验时将保存病毒株传一代后，培养瓶迅速冻融 3 次，离心去细胞碎片。滴定后实验结果：按 Read-Much 公式计算 TCID50为 10-4.7。3..1.3 心肌酶及心肌 cTnI 的测定如表 1 所示，在心肌细胞感染 HCMV 后的第 3 天时，AST、CK、CK-MB及 cTnI 与正常对照组相比无显著性差异（p>0.05）,而在第 5 天及第 7 天时 AST、LDH、CK、CK-MB 及 cTnI 均明显高于正常对照组（p<0.05）。说明在感染 HCMV5天后心肌细胞已出现了损伤，且随着感染的延伸其心肌酶有逐渐升高趋势。

心肌细胞,免疫荧光

3.1.4 HCMV 感染心肌细胞免疫荧光结果用 HCMV pp65 单克隆抗体对 HCMV 感染的 SD 大鼠乳鼠的心肌细胞进行免疫荧光检测，我们可见有苹果绿色荧光阳性信号位于被感染的心肌细胞的胞核中。如图 3 所示。阴性对照未见任何阳性信号。3.1.5 HCMV 感染心肌细胞表达早期蛋白用鼠抗人巨细胞病毒（CMV-EA）单克隆抗体与 HCMV 感染的 SD 大鼠乳鼠的心肌细胞作用，在倒置显微镜下观察，可见有红褐色的阳性信号位于被感染的心肌细胞的胞核中。如图 4 所示。

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