新生儿窒息后血清诱导HK-2细胞凋亡的胞内信号传导机制研究

发布时间：2020-10-09 14:46

　　背景:新生儿窒息可以发生在产前,产时或者产后期。我国现在每年出生约2000万新生儿,窒息发生率占活产新生儿的5%-10%,新生儿窒息是当前我国新生儿死亡的第一位死因,也是致残的重要原因。窒息后多脏器血流动力学变化和各脏器间的血流再分配可导致多器官功能损伤,即缺血再灌注损伤。相关研究表明窒息后的多器官功能损伤中肾损伤的发生率最高,而肾小管作为肾单位的主要结构之一,其损伤发生最早,进一步证明损伤最早、最敏感的靶细胞是肾近曲小管上皮细胞。　我们的前期研究发现,新生儿窒息后肾损伤组外周血白细胞计数明显高于非损伤组,且与肾功能损伤程度呈正相关;在窒息大鼠恢复供氧的模型中进一步观察到肾组织白细胞滞留数明显增多。说明一些炎症细胞因子(IL-8,TNF-α等)及大量氧自由基的产生对窒息的发病及肾损伤的发生起重要作用。我们还观察到用新生儿窒息后血清来处理培养的HK-2细胞其凋亡率增加,证明凋亡是窒息后肾损伤的一种形式。但是,窒息后血清诱导肾小管上皮细胞凋亡的胞内信号传导机制仍不清楚。线粒体作为真核细胞内能量生成的场所,是窒息后细胞损伤最敏感的细胞器。而且在细胞凋亡内外多条信号通路中,线粒体通过释放各种凋亡蛋白形成调控细胞凋亡的中心环节。那么,在窒息后血清诱导肾小管上皮细胞凋亡中是否有线粒体途径的激活呢? 核因子-κB(NF-κB)作为调节细胞基因转录的关键因子之一,是炎症反应的触发器及关键环节。已证实NF-κB是调节编码多种前炎症介质、细胞因子和粘附分子基因的重要转录因子。目前研究证实窒息后血清诱导HK-2细胞凋亡的机制牵涉到NF-KB的活化。活化后的核因子 κB是否参与线粒体途径的激活呢? 因此,本研究在前期实验的基础上,探讨新生儿窒息后血清对HK-2细胞内线粒体膜电位变化,相关凋亡蛋白释放以及促凋亡蛋白表达的影响及其与NF-κB活化的关系,旨在阐明窒息后肾小管损伤的机制。目的:研究新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的胞内信号传导机制。方法:(1)以人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象,用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基进行传代培养。(2)新生儿窒息后血清的制备:选择2006年9月～2007年6月在我科住院的未使用免疫抑制剂、无明显感染性疾病的足月重度室息新生儿。在窒息后24h抽取外周血5 mL(肝素抗凝),离心并分离出血清,灭活补体后-20℃保存备用。(3)窒息后血清诱导HK-2细胞损伤模型的建立:采用上述方法处理的窒息后血清,用DMEM/F12培养液配成20%(体积比,v/v)的攻击浓度,攻击正常培养的HK-2细胞。(4)实验分组:共分为三组,即正常对照组、窒息组和吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)干预组。PDTC是NF-κB的特异性抑制剂,根据前期实验结果,我们应用的终浓度为40μM。即在实验前24h将培养液换成含20%窒息血清的DMEM培养液的同时加入40μM PDTC。(5)检测指标:倒置相差显微镜下观察HK-2细胞生长情况;激光共聚焦显微镜测HK-2细胞线粒体膜电位(MMP)变化;免疫细胞化学方法检测HK-2细胞胞浆内促凋亡蛋白Bad、Bax的表达情况;Western blot测HK-2细胞内线粒体中CytC,AIF的释放情况。(6)统计学分析:采用one-way ANOVA分析,组间比较用LSD法。数据均用x±s表示,采用SPSS10.0软件处理。P0.05为差异有统计学意义。结果:(1)倒置相差显微镜下观察到对照组细胞贴壁生长,呈类上皮样扁平多角形,折光性强,细胞间连接紧密,分裂像多,数量多。窒息组细胞生长减慢,贴壁性差,细胞数量较对照组明显减少,形态变为不规则圆形或椭圆形,折光性减弱,胞质中出现空泡,脂滴,颗粒样物,细胞间连接松散,并可见较多细胞碎片。PDTC干预组较对照组细胞数量变化不大,形态变化小,部分细胞有收缩变圆,细胞折光性较强。(2)与正常对照组(2.96±0.38)相比,窒息组(0.87±0.06)和PDTC干预组(2.46±0.52)细胞线粒体膜红/绿荧光强度比值(590/530nm)明显降低,差异具有显著性意义(P0.01)。但与窒息组相比,PDTC干预组细胞线粒体膜红/绿荧光强度比值明显升高,差异有显著性意义(P0.01)。(3)用HSCORE系数作半定量评分,与正常对照组[(1.97±0.26)和(1.77±0.11)]相比,窒息组[(2.73±0.20)和(2.44±0.13)]和PDTC干预组[(2.38±0.13)和( 2.17±0.08)]促凋亡蛋白Bad、Bax的表达均明显增加,差异具有显著性意义(P0.01);但与窒息组相比,PDTC干预组促凋亡蛋白Bad、Bax的表达显著减少,差异有统计学意义(P0.01)。(4)正常组HK-2细胞的胞浆中不含细胞色素C,主要存在于线粒体内,条带光密度值分别为(156.5±3.54,179.5±2.12);窒息组胞浆中细胞色素C从线粒体漏出较对照组明显增加,相应的在线粒体内表达减少,条带光密度值分别为(177.5±3.54,155±4.24),差异有统计学意义(P0.05);PDTC干预组胞浆中细胞色素C表达也有所增加,但大部分仍位于线粒体内,条带光密度值分别为(165±4.24,171±5.66),与窒息组相比,差异有统计学意义(P0.05)。(5)正常组HK-2细胞中AIF主要存在于线粒体内,条带光密度值为(212±4.24);窒息组HK-2细胞中AIF从线粒体中漏出,在线粒体内基本检测不到AIF表达,条带光密度值为(128±4.24);PDTC干预组较窒息组线粒体内AIF表达明显增加,条带光密度值为(201±8.49),组间比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:新生儿窒息后血清可诱导人HK-2细胞凋亡,其胞内信号机制涉及到NF-κB活化后上调各种炎症细胞因子、促凋亡Bcl-2家族蛋白表达,从而使线粒体膜电位下降、耗散,线粒体膜间隙蛋白释放,使凋亡进入不可逆程序。提示稳定线粒体膜功能,切断凋亡级链反应中的上游环节可能会减轻窒息后肾损伤的发生。
【学位单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2008
【中图分类】：R722.12
【部分图文】：

血清诱导,细胞损伤,倒置显微镜,附图

附图 1 窒息后血清诱导 HK-2 细胞损伤的形态学变化（倒置显微镜×200）(a)对照组； (b)窒息组； (c) PDTC 干预组。Figure 1 HK-2 microstructure changes induced by postasphyxial-serum; (a) Contro(b) Asphyxia group; (c) PDTC blocking group.

细胞线粒体,血清诱导,激光共聚焦显微镜,膜电位

附图附图 1 窒息后血清诱导 HK-2 细胞损伤的形态学变化（倒置显微镜×200）(a)对照组； (b)窒息组； (c) PDTC 干预组。Figure 1 HK-2 microstructure changes induced by postasphyxial-serum; (a) Contro(b) Asphyxia group; (c) PDTC blocking group.

倒置显微镜,血清,附图,对照组

附图 3 窒息后血清上调 HK-2 细胞胞浆内 BAD 的表达（倒置显微镜×200）(a)对照组； (b)窒息组； (c) PDTC 干预组。Figure 3 Immunocytochemical analysis of proapoptotic protein Bad in HK-2 cells.(a) Control; (b) Asphyxia group; (c) PDTC blocking group.附图 4 窒息后血清上调 HK-2 细胞胞浆内 BAX 的表达（倒置显微镜×200）(a)对照组； (b)窒息组； (c) PDTC 干预组。Figure 4 Immunocytochemical analysis of proapoptotic protein BAX in HK-2 cells.(a) Control; (b) Asphyxia group; (c) PDTC blocking group.

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