研究背景及目的:支气管哮喘(以下简称哮喘)是由多种炎症细胞和结构细胞(如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、气道上皮细胞、平滑肌细胞等)共同参与的气道慢性炎症性疾病。通常表现为广泛的可逆性呼气气流受限,患者可出现反复发作的喘息、咳嗽、胸闷、气急等症状,多在凌晨和夜间发作或加剧。支气管哮喘如不及时治疗或控制,会出现气道重塑等不可逆的病理改变,严重影响患者的生活质量。近几十年来,哮喘在全球范围内的患病率成逐年上升的趋势。在世界范围内,哮喘患者已经超过3亿,而我国则超过了 3000万。哮喘给患者和社会带来了巨大的心理和经济负担,因此对哮喘发病原因和机制的研究至关重要。哮喘的发生是遗传和环境因素共同作用的结果。它是一种有明显家族聚集倾向的多基因遗传性疾病。同时,哮喘的发生发展还与环境因素密切相关。我们所接触的外部环境,如过敏原、大气污染物、气象因素、病原微生物等都认为与哮喘有着密切的联系。除了外部环境,机体内部的微生态环境也对哮喘的发生发展起到了至关重要的作用。外部及内部环境的共同作用会对幼年时期的机体免疫系统成熟发展的过程产生影响,从而导致儿童哮喘的发生。机体的内环境主要由共生在体内的微生物群落所组成,除了所熟知的胃肠道,皮肤、呼吸道、泌尿道等各系统也都有其特定的微生物定植,组成了机体独特的微生态系统。当微生态系统受到一些因素的影响而失衡时,会引起一些疾病(如炎症性肠病、特异性皮炎、代谢性疾病、心血管疾病等)的发生。研究表明,生命早期是机体微生态系统从无到有、发展成熟的重要时期,在这一阶段某些外在因素的干扰会导致微生态系统的失衡,从而对机体的健康产生影响。近年来,随着医疗水平和经济的发展,生活方式、饮食习惯、医疗干预等都会影响体内微生态系统的组成。其中抗生素的使用在儿童中越来越普遍,虽然它能够有效的杀灭病原菌,但同时也会破坏机体内部的微生态系统,造成暂时或持续的微生态系统的失衡,引起免疫紊乱,从而影响免疫相关性疾病的发生发展。人体每日所接触到的外部环境也与哮喘的发生有着密切的关系。随着社会经济的发展,大气污染的形势日益严峻。大气细颗粒物(PM2.5)是大气污染物中的重要组成成分,它特殊的理化性质使得其能随着空气直接深入到细支气管和肺泡,干扰肺部的气体交换,引起一系列呼吸系统疾病的发生。同时,全球变暖大陆气温升高,导致一系列伴随效应的发生。极端天气的出现会对哮喘患者的病情产生影响。因此,探究气象因素与哮喘的发生与发展之间的关系显得十分迫切。由此,我们拟通过探讨内外环境与哮喘发生发展之间的联系来讨论影响哮喘发生发展的因素。在实验过程中分别从临床和动物模型两方面研究内环境和外环境对哮喘发生发展的影响,试图为今后哮喘的早期防治提供实验依据和新的思路。研究对象与方法:(1)对哮喘患儿及健康儿童进行回顾性的问卷调查,具体内容包括:基本情况、哮喘发病情况、个人及家族过敏史、出生喂养史、抗生素使用情况、香烟暴露情况等。利用统计学方法,寻找在遗传背景、生活方式、抗生素的使用情况等方面与哮喘发生可能相关的危险因素。(2)在生命早期使用万古霉素干预C57BL/6小鼠,并在小鼠6周龄时停用万古霉素后予以建立OVA诱导的哮喘模型。模型建立成功后检测肺泡灌洗液中细胞总数及分类细胞计数的情况,并通过病理切片染色观察气道周围炎症浸润及气道内粘液分泌情况,利用Q-PCR方法检测相关细胞因子的表达,观察万古霉素的干预对后续哮喘的气道炎症所产生的影响。同时使用16S rDNA测序的方法对肠道和气道微生态系统的组成进行分析,探讨万古霉素暴露后机体微生态系统的变化情况。(3)收集2014年-2017年气象因素(温度、PM2.5、PM10)的月均数据,并统计相应月份浙江大学医学院附属儿童医院哮喘儿童的就诊情况及全院门急诊量。对气象因素与哮喘患儿就诊情况进行关联分析,寻找气象条件与哮喘发病的相关性。(4)分别利用不同温度条件(10℃、20℃、30℃)对小鼠哮喘模型进行干预。建立HDM诱导的哮喘模型,并进行PM2.5的短期暴露。通过对哮喘动物模型的处理,检测肺泡灌洗液中细胞总数及分类计数的情况,观察气道周围炎症浸润及气道内粘液分泌情况,及检测相关细胞因子的表达,分别观察不同温度条件及PM2.5对哮喘气道炎症所产生的影响。结果:(1)通过回顾性调查问卷分析,发现儿童哮喘以冬季最为多发,发作诱因以呼吸道感染最为常见。哮喘儿童中相关过敏性疾病的发生比健康儿童显著增加,其中哮喘患儿合并过敏性鼻炎的比例最高。哮喘儿童中过敏性家族史及过敏原检测阳性率高于健康对照组儿童,尘螨为哮喘儿童最为常见的过敏原。抗生素在哮喘儿童中首次暴露的时间比健康儿童提前,1岁内和3岁内抗生素使用的次数也较健康儿童多。同时,哮喘儿童中3岁内抗生素使用的最长疗程明显长于对照组儿童。经过Logistic回归分析,发现过敏原检测阳性、过敏家族史、3岁内使用抗生素次数这三项为儿童哮喘发病的危险因素。(2)在小鼠的哮喘模型中,我们发现生命早期万古霉素的干预会加重后续哮喘发生的气道炎症反应。同时,万古霉素的暴露会引起肠道及气道微生态的失衡,其中肠道内厚壁菌的减少及气道内Clostridiaceae-1和Micrococcaceae的减少可能与Th2免疫反应的上调及哮喘气道炎症的加重有关。进一步实验研究发现,生命早期短时间的万古霉素暴露并不会导致哮喘气道炎症的加重。(3)对气象因素(温度、PM2.5、PM10)与哮喘就诊情况进行相关性分析后发现,月均温度与哮喘儿童的就诊量及哮喘就诊比例呈现明显的负相关,并且这一现象在小于6岁的儿童中表现得比较明显。月均PM2.5的浓度与哮喘儿童急诊就诊人次存在较为明显的正相关,在小于6岁的儿童中,PM2.5还与哮喘就诊比例有着明显的相关性。月均PM10的浓度变化与哮喘急诊人次和哮喘就诊比例存在中等程度的正相关性,并且这一相关性在小于6岁儿童中更为明显。(4)哮喘模型小鼠在10℃、20℃、30℃这三种不同环境温度的干预下,其气道中的炎症细胞及粘液分泌情况和相关细胞因子的表达并无明显差异。对HDM诱导的哮喘模型进行PM2.5的短期暴露会增加肺泡灌洗液中的炎症细胞数量,引起气道周围炎症细胞的浸润和气道内粘液分泌的增加,同时肺组织内GM-CSF和IL-33及Th2相关细胞因子的表达增加。结论:(1)过敏原检测阳性、过敏家族史、3岁内使用抗生素次数是儿童哮喘发生的危险因素。(2)生命早期万古霉素的使用可能通过改变肠道和气道微生态、上调Th2免疫反应导致后续哮喘模型的气道炎症反应的加重。(3)月均环境温度、PM2.5及PM10的浓度可能与哮喘发病有关,小于6岁的儿童尤为明显。(4)不同的温度条件不会引起哮喘小鼠气道炎症的改变。PM2.5的短期暴露会引起肺组织内GM-CSF和IL-33的表达增加,增加Th2相关细胞因子的分泌,加重HDM诱导的小鼠哮喘模型的气道炎症反应。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R725.6
【部分图文】：
浙江大学博士学位论文?正文第一部分（二）材料和方法??配现用。??（７）?７５％乙醇：取９９．９％无水乙醇，按３：?１比例加入适量ｄｄＨ２０，充分搅拌??混匀，即配置成７５％乙醇。??（８）万古霉素溶液：称取２００ｍｌ万古霉素溶于１０００ｍｌ?ｄｄＨ２０中，配置成??２００ｍｌ／Ｌ浓度溶液。??２．２．５实验方法：??２．２．５．１主要实验流程图：??ＢＡＬＦ总细胞及分类细胞计数??
２．２．５．３哮喘模型的构建??（１）致敏：在模型建立的第０天和第１４天，哮喘组（ＯＶＡ組）和万古霉素??哮喘组（ＶＡＮ－ＯＶＡ组）小鼠腹腔注射致敏液０．２ｍｌ?（８０陴）／只小鼠，??生理盐水对照组及万古霉素对照组小鼠腹腔注射生理盐水０．２ｍｌ。??（２）激发：在模型建立第２４、２５、２６天，哮喘组（ＯＶＡ组）和万古霉素哮??喘组（ＶＡＮ－ＯＶＡ组）小鼠被放置至密闭容器中通过超声雾化装置吸入??１．５％０ＶＡ雾化激发液８ｍｌ，雾化时间为４０ｍｉｎ／次／天。生理盐水对照组??和万古霉素对照组小鼠用生理盐水８ｍｌ替代雾化激发液，同一方法雾化??４０ｍｉｎ。??３２??
万古霉素对照组（ＶＡＮ－ＮＳ）的小鼠肺组织切片中气道周围几乎看不到炎症细胞的??浸润。而哮喘组（ＯＶＡ）以及万古霉素哮喘组（ＶＡＮ－ＯＶＡ）小鼠的气道周围存在??着不同程度的炎症细胞浸润（图２．４?Ａ），符合ＯＶＡ诱导的哮喘模型病理切片Ｈ＆Ｅ??染色的表现。经过进一步评分统计后，我们发现与哮喘组相比（ＯＶＡ），万古霉素??干预后哮喘小鼠的气道周围炎症细胞浸润的数目和层数明显增加，两组间比较存??在显著性差异（Ｐ＜０．０００１）（图２．４Ｂ）。??４４??
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2835159
