抑制S1PR3促进儿童急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡研究

发布时间：2020-10-18 17:08

　　 第一部分儿童急性T淋巴细胞白血病中GPCRs表达紊乱目的:通过高通量RNA转录组测序(High through-put RNA sequencing,RNA-seq)检测儿童急性T淋巴细胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)肿瘤细胞中差异表达的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)基因。方法:收集13例初发儿童T-ALL骨髓样本,通过Ficoll淋巴细胞分离液分离T-ALL肿瘤细胞;收集4例健康儿童外周血样本,通过人T细胞提取试剂盒分离正常T细胞;提取T-ALL肿瘤细胞及正常T细胞RNA,进行RNA-seq,检测基因mRNA表达水平;通过R语言分析TALL肿瘤细胞及正常T细胞差异表达基因并绘制差异表达基因热图及火山图;通过Gene Ontology对差异表达基因进行GO分析。结果:RNA-seq分析结果显示,相对于健康儿童外周血正常T细胞,13例T-ALL患儿骨髓肿瘤细胞中存在大量肿瘤相关通路基因表达异常;大量GPCRs表达异常;差异表达GPCRs进行GO分析,存在其中鞘氨醇-1-磷酸盐(Sphingosine-1-Phosphate,S1P)信号通路相关基因富集。结论:儿童急性T淋巴细胞白血病骨髓细胞中存在大量异常表达的GPCRs基因,其中S1P信号通路相关基因异常富集。第二部分S1PR3在儿童急性T淋巴细胞白血病中表达增加目的:分析RNA-seq数据S1P信号通路相关基因表达情况;通过查询GEO数据库分析多组T-ALL研究数据S1P信号通路相关基因的表达;在T-ALL细胞系及病人样本中对S1P信号通路相关基因进行验证。方法:分析RNA-seq数据中S1P信号通路相关基因的表达情况。检索GEO数据库,分析多个研究组数据T-ALL中S1P信号通路相关基因表达情况。收集初发儿童T-ALL骨髓上清及非肿瘤患者骨髓,通过ELISA检测骨髓上清S1P及其运载体载脂蛋白M(Apolipoprotein M,Apo M)表达。通过GEO数据库,分析T-ALL细胞中S1P信号通路相关基因的表达情况。收集健康儿童外周血,人T细胞提取试剂盒提取正常T细胞;收集健康儿童胸腺组织,研磨、过滤后获得胸腺细胞;收集非肿瘤患者骨髓,Ficoll淋巴细胞分离液单个核细胞,进一步磁珠分选得CD34+骨髓细胞;收集初诊儿童T-ALL骨髓样本,Ficoll淋巴细胞分离液分离T-ALL肿瘤细胞;培养T-ALL各细胞系细胞;提取细胞RNA,通过Q-PCR检测正常T细胞、CD34+骨髓细胞及T-ALL细胞系中SPHK1、SPHK2及SGPL1的表达水平。通过Q-PCR检测正常T细胞、正常胸腺细胞、CD34+骨髓细胞及T-ALL细胞系中S1PR3的表达水平。通过流式细胞仪检测T-ALL细胞系细胞膜S1PR3的表达水平。通过Q-PCR检测外周血T细胞、临床T-ALL肿瘤细胞S1PR3表达情况。结果:RNA-seq发现与正常T细胞相比,S1P合成酶SPHK2在TALL肿瘤细胞中表达增加,S1P降解酶SGPL1表达下降,S1PR3在TALL肿瘤细胞中表达显著增加,S1PR1、S1PR2、S1PR4及S1PR5表达相对减少。GEO数据库多个T-ALL研究组数据显示,T-ALL肿瘤细胞S1PR3表达显著增加,SPHK1、SPHK2表达相对增加,S1PR1、S1PR2、S1PR4及S1PR5表达相对减少,SGPL1表达相对减少。ELISA检测结果显示T-ALL骨髓上清中S1P及Apo M表达无明显差异。GEO数据库分析及Q-PCR验证结果显示,与外周血T细胞、胸腺细胞、CD34+骨髓细胞相比,T-ALL细胞系S1PR3表达显著增加,SPHK2表达增加,SGPL1表达下降。流式细胞仪结果显示T-ALL细胞系中,JK细胞表面S1PR3表达最高,其次为CEM、MOLT4、CUTLL1。临床患者肿瘤细胞Q-PCR结果显示,T-ALL中S1PR3的表达水平显著增加。结论:分析GEO数据库T-ALL相关研究、同时在T-ALL细胞系及病人样本中进行验证,发现S1P信号通路相关基因在T-ALL差异表达,其中S1PR3表达显著增加。第三部分抑制S1PR3促进儿童急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡目的:检测S1PR3分子在体外对T-ALL细胞凋亡的作用方法:通过S1PR3特异性小分子抑制剂TY52156(0、1、3、7、10、15u M)、CAY10444(0、3、5、10、20、30u M)分别作用于T-ALL细胞系,通过Annexin V-APC/7-AAD染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。收集并培养原代T-ALL病人肿瘤细胞,CAY10444(0、3、5、10、20、30u M)作用后Annexin V-APC/7-AAD染色,流式细胞仪检测抑制细胞凋亡,激光共聚焦观察Cleaved-caspase3+细胞比例。通过TY52156(0、7、15u M)、CAY10444(0、10、30u M)分别作用于CD34+骨髓细胞,通过Annexin V-APC/7-AAD染色,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:流式细胞仪检测结果显示,S1PR3特异性小分子抑制剂可显著促进T-ALL细胞凋亡,凋亡比例呈药物浓度依赖性;TY52156作用于CEM、MOLT4、JK、CUTLL1的IC50分别为5.23u M、5.78 u M、5.93u M、6 u M。CAY10444作用于CEM、MOLT4、JK、CUTLL1的IC50分别为10.12 u M、13.17 u M、21.59 u M、27.22 u M。S1PR3特异性小分子抑制剂CAY10444作用于1例原代T-ALL病人肿瘤细胞,在30u M时引起88%白血病细胞凋亡。S1PR3特异性小分子抑制剂CAY10444作用于1例原代T-ALL病人肿瘤细胞,激光共聚焦观察Cleaved-caspase3+细胞比例随药物浓度逐渐增加。流式细胞仪检测结果显示,S1PR3特异性小分子抑制剂TY52156、CAY10444分别对CD34+骨髓细胞凋亡无明显影响。结论:特异性抑制S1PR3促进T-ALL细胞凋亡。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R733.71
【部分图文】：

18图 1.1 RNA-seq 检测 T-ALL 患者肿瘤细胞基因表达Figure 1.1 The gene expression of the clinical patient’s T-ALL cells detected by RNA-seq2.2 与正常 T 细胞相比，T-ALL 肿瘤细胞存在大量异常表达的GPCRs为进一步分析 T-ALL 肿瘤细胞中异常表达的 GPCRs，从 GPCRdb 数据库检索出现有的约 900 个 GPCRs，通过 R 语言对 RNA-seq 数据中的 GPCRs 进行基因差异

图 2.1 T-ALL 临床标本中 S1P 信号通路相关基因的表达Figure 2.1 The mRNA expression of S1P signal related genes in the clinical T-ALL samples.2.2 检索 GEO 数据库，多组 RNA-seq 数据中 S1P 信号通路相关基因表达紊乱为进一步明确 S1P 信号通路相关基因在 T-ALL 样本中的表达情况，GEO 数据库检索多中心 RNA-seq 数据，通过 R 语言进行基因差异表达分析。结果显示，GSE48558 组（T-ALL 13 例，Ctrl 17 例）中 T-ALL 细胞 SPHK2 表达增加（图2.2A），S1PR1、S1PR4、S1PR5 表达下降， S1PR3 表达显著增加（图 2.2B）。GSE66638 组（T-ALL 8 例，Ctrl 2 例）中 SPHK2 表达增加（图 2.2C），S1PR3 表达无统计学差异。上述结果与我们的 RNA-seq 数据基本吻合，均提示，T-ALL 细胞

图 2.2 GEO 数据库 T-ALL 临床标本中 S1P 信号通路相关基因的表达Figure 2.2 The mRNA expression of S1P related genes in the clinical T-ALL samples from GEOdatabase.2.3 S1P 及其运载体 ApoM 在 T-ALL 病人样本中表达无明显差异为验证 T-ALL 临床样本中 S1P 及其运载体表达情况，我们收集了 5 例非肿瘤童骨髓样本及 8 例初诊儿童 T-ALL 骨髓上清，通过 ELISA 检测 S1P 及 ApoM 水平。结果显示两组间 S1P 及 ApoM 的表达无明显差异（图 2.3A、B），提示 S1P 在患者骨髓中无异常。由于收集骨髓过程中样本多发生了溶血，而 S1P 为红细胞内产生，推测 S1P 的检测不准确，不能排除 S1P 在患者骨髓中异常。
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本文编号：2846575