未成熟脑缺血损伤中影响神经干细胞微环境的因素及其作用途径

发布时间：2020-10-20 09:57

　　 【目的】神经干细胞(neural stem cell,NSC)微环境是调控神经干细胞增殖分化和自我更新的关键。目前对未成熟脑缺血性损伤中影响神经干细胞微环境的因素及其作用途径知之甚少。本课题通过研究未成熟脑缺血后神经干细胞的增殖分化及其微环境的相关变化,探讨缺血性损伤影响神经干细胞增殖分化的作用途径,并通过对血管内皮细胞分泌因子影响神经干细胞增殖分化的研究,进一步阐明其影响神经干细胞微环境的信号通路。此外,通过研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)干预对未成熟脑缺血后神经新生的作用,为早产儿脑损伤的治疗探索新的途径。 【方法】一.采用3日龄新生SD大鼠96只,随机分为实验组和对照组。实验组分离并结扎双侧颈总动脉,制备脑缺血模型;对照组仅分离,不结扎。两组大鼠分别于术后24h、4d、7d、14d处死取脑:1.采用免疫荧光染色方法,观察缺血对脑室下区(subventricular zone,SVZ)不同时点神经干细胞新生和增殖分化的影响;2.利用基因芯片技术,分析SVZ缺血后基因表达的变化,寻找缺血性损伤调控SVZ微环境变化的信号通路;3.采用real-time PCR、Western blot方法分别从基因和蛋白水平对发现的信号分子进行验证。 二.应用transwell共培养系统,建立3日龄新生SD大鼠SVZ脑片培养模型,随机分为三组:共培养组(血管内皮细胞+脑片)、共培养+siRNA组(血管内皮细胞+脑片+VEGF siRNA)和对照组(仅培养脑片)。其中血管内皮细胞采用ATCC鼠脑微血管内皮细胞株(bEnd.3,No.CRL-2299~(TM)),siRNA干扰采用脂质体转染法。脑片分别培养至第4d、7d、10d:1.采用免疫荧光染色的方法,观察血管内皮细胞分泌因子对脑片中神经干细胞增殖,及其向不同功能神经细胞分化的影响;2.通过基因芯片技术,分析在此过程中血管新生与神经新生相关基因表达的变化,探讨血管内皮细胞影响神经干细胞增殖分化的作用途径与机制,并采用real-time PCR方法对关键信号分子进行验证。 三.通过结扎3日龄新生SD大鼠双侧颈总动脉方法制备脑缺血模型后,随机分为治疗组(54只)和非治疗组(54只)。治疗组给予bFGF(10ng/g)侧脑室注射,非治疗组注射2μl生理盐水。另取54只3日龄新生SD大鼠作为假手术对照组(仅分离双侧颈总动脉,不结扎,不给予药物)。三组大鼠分别于术后第4d、7d、14d获取脑组织标本,采用免疫荧光双标、Western blot和real-time PCR的方法,观察三组大鼠不同时点SVZ巢蛋白(Nestin)、NeuN、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和少突胶质细胞NG2蛋白及其mRNA的表达变化,研究bFGF对神经干细胞新生和增殖分化的作用。 【结果】一.未成熟脑缺血性损伤后:1.脑组织病理切片可见SVZ神经细胞变性、坏死,细胞层次紊乱、排列松散,部分神经细胞固缩、胞浆深染、核浓缩,结构不清,以术后第4d损伤最重;2.免疫荧光标记结果显示SVZ新生细胞显著增加,包括神经干细胞(BrdU+/Nestin+)、神经元(BrdU+Tuj1+)、星形胶质细胞(BrdU+/GFAP+)和少突胶质细胞(BrdU+/O4+)数目均较对照组增加(P＜0.01),7d达高峰;3.基因芯片分析发现,与缺血后SVZ神经干细胞增殖分化相关的基因主要涉及VEGF、TGF-β1两条信号通路,定量分析结果显示VEGF、TGF-β1 mRNA和蛋白表达在缺血后均增加,7d达高峰,与对照组比较差异有统计学意义(p＜0.01)。 二.血管内皮细胞对未成熟脑神经干细胞的影响:1.共培养组神经干细胞(Nestin+)明显增加,在共培养7d达高峰,并且神经元(Tuj1+)、星形胶质细胞(GFAP+)和少突胶质细胞(O4+)数量亦增加,在共培养10d达高峰,与对照组和共培养+siRNA组相比,差异显著(P＜0.01)。2.与血管和神经新生相关的基因表达谱变化显示,共培养组有112个基因表达较对照组2倍以上升高,给予siRNA干预后,这112个上调的基因中有81个表达呈2倍以上降低。利用基因芯片显著性分析方法(significance analysis of microarray,SAM)筛选具有显著性表现的基因,并利用KEGG数据库将这些差异表达基因按照信号通路进行映射,发现显著性表现的基因主要涉及Notch和Pten信号通路,这两条信号通路与血管新生和神经干细胞增殖分化的调控有关。采用real-time PCR方法对这两条通路中主要基因进行验证,得到与芯片数据一致的结果。 三.未成熟脑缺血损伤后给予bFGF干预组:1.SVZ病理改变较对照组明显减轻;2.SVZ各种新生细胞(BrdU+)数量均较对照组显著增加,其中新生神经干细胞(BrdU+/Nestin+)在7d达高峰,而新生的神经元(BrdU+/NeuN+)、星形胶质细胞(BrdU+/GFAP+)和少突胶质细胞(BrdU+/NG2+)在14d达高峰,与非干预缺血组相比,差异均有显著意义(P＜0.01);3.Nestin蛋白和mRNA表达都在7d达高峰,NeuN、GFAP和NG2的蛋白和mRNA表达均在14d达高峰,与非干预缺血组相比,差异均有显著意义(P＜0.01)。 【结论】1.缺血促进未成熟脑SVZ神经干细胞的增殖及其向功能神经细胞的分化;2.VEGF和TGF-β信号通路参与调控缺血后神经干细胞的增殖分化,是缺血性损伤影响未成熟脑神经干细胞微环境的重要途径;3.血管内皮细胞分泌的可溶性细胞因子和对血管新生相关基因的抑制可影响神经干细胞的微环境,调节神经干细胞的增殖和分化;4.血管内皮细胞与神经干细胞的相互作用涉及多条通路,主要与Notch和Pten信号通路有关;5.bFGF干预可促进未成熟脑缺血后的神经新生,可能有助于缺血性损伤后的神经修复。
【学位单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2009
【中图分类】：R748
【部分图文】：

2.准备RNA样品:取2林gRNA样品，加2川goklview上样染液，混匀;3.电泳:上样于胶孔中，100V电压下电泳至澳酚兰指示剂进胶至少2一3。m4.紫外透射光下观察并拍照:凝胶电泳显示285和18sRNA(图1一2)。图1一2琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

仁明显;缺血组大鼠SVZ神经细胞变性、坏死，细胞层次紊乱、排列松散，部分神经细胞固缩、胞浆深染、核浓缩，结构不清，术后第4d最重，术后第7d病理改变逐渐减轻(图1一6)。图1一6术后 4dSVZ脑组织病理变化(HE染色)。al和bl分别为a和b框中的放大图。缺血组存在广泛的细胞水肿、神经细胞坏死和局灶的脑软化，对照组无病理变化(a， bB沪100林m;al，blB护50林m)。二.缺血后Svz神经干细胞的增殖分化为观察新生细胞是否为神经细胞，本研究采用免疫组化双标记的方法，BrdU标记新生细胞，Nestln标记神经干细胞，Tujl标记神经元，G凡J标记星形胶质细胞

图1一8不同时点SVZ双标阳性细胞定量分析。A:BrdU十加estin+细胞数目变化，表示新生神经干细胞;B:BrdU+汀uj卜细胞数目变化，表示新生神经元;C:Brdu+/GFAP+细胞数目变化，表示新生星形胶质细胞;D:BrdU+/04+细胞数目变化，表示新生少突胶质细胞。数值以均数士标准差表示，*尸<0.01。三.缺血后不同时点SVZ基因表达的相关变化(一)缺血后SVZ基因表达谱变化为了观察缺血后SVZ基因表达变化，从而发现在促进神经干细胞增殖分化中起主要作用的因子，本研究选择A伪metrixRat2302.0芯片，采用基因芯片技术观察缺血后SVZ基因表达变化。在所观察的2400个基因中，缺血后SVZ有82个基因表达较对照组呈3倍以上升高，39个呈3倍以上的降低。采用基因本体数据库(GeneOntology，Go)分析，这些差异基因主要涉及蛋白修饰、免疫和炎症反应、细胞凋亡、细胞生长和细胞周期的调控。在这些差异基因中，有21个基因与细胞死亡、增殖分化相关。其中，9个基因缺血后表达上调，12个基因表达下调(表1一4)。
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

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3 黄孝文,肖红俊,汪吉宝,黄翔;用BrdU标记技术观察大鼠内淋巴囊的S期细胞[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2002年04期

本文编号：2848538