首例非白人婴儿肝衰竭综合征1型患儿临床特点和分子诊断研究

发布时间：2020-10-22 07:24

　　 婴儿肝衰竭综合征1型(ILFS1)是一种由胞质亮氨酰-t RNA合成酶基因(LARS)突变所导致的常染色体隐性遗传病。本研究报道首例非白人ILFS1患者的临床特点和分子诊断经过,为ILFS1的诊治提供参考。患者为2岁9个月男孩,因发现肝脾肿大1年余就诊。1岁5个月时发现肝脾大,实验室检查发现丙氨酸氨基转移酶和门冬氨酸氨基转移酶偏高、低蛋白血症、凝血功能异常和贫血,肝脏病理提示肝硬化和脂肪肝;SLC25A13基因高频突变筛查和一代测序分析仅检测到一个父源性突变c.1658GA,cDNA克隆分析也未发现母源性SLC25A13等位基因异常转录子;代谢性肝病相关基因外显子组捕获二代测序在患儿LARS基因检出父源性突变c.2133_2135del(p.L712del)和母源性突变c.1183GA(p.D395N),经一代测序验证,最终确诊为ILFS1。目前随访至4岁,肝功能正常,无贫血,仍有低蛋白血症。
【部分图文】：

1.3SLC25A13cDNA克隆分析参考文献[14]进行SLC25A13cDNA克隆分析。用淋巴细胞分离液（MPBiomedicals，美国）分离外周血淋巴细胞，加RNAisoplus（TaKaRa,日本）裂解细胞后，提取总RNA。以总RNA为模板，按照M-MLV逆转录酶（Invitrogen,美国）说明书合成第一链cDNA。巢式PCR扩增SLC25A13基因编码区，切胶纯化PCR产物后与PMD18-TVector（TaKaRa,日本）进行连接克拢转化感受态细胞，涂布于加有Amp（50~100μg/mL）的LB平板培养基上，37℃培养箱培养过夜，形成单菌落。随机挑选单菌落，接种于含Amp的500μLLB液体培图1肝脏组织病理检查结果A（HE染色，100×）：肝内大小不等的结节形成，纤维瘢痕及纤维间隔内大量炎细胞浸润，轻度界面炎，部分结节内肝细胞大泡性脂肪变性；B（Masson染色，100×）：纤维组织增生分隔肝实质（胶原纤维绿色，肌纤维红色）；C（CK19染色，200×）：小胆管增生明显（棕色，如箭头所示）；D（Vimentin染色，200×）：窦周纤维化（棕色，如箭头所示）。养基中，37℃振荡培养3~5h。取1μL菌液为模板，进行PCR扩增，电泳检测有无目的条带，并挑选24个阳性克隆菌液进行Sanger测序。1.4靶向外显子组捕获测序分析提取基因组DNA3~5μg，将其打断、扩增，建立含有与代谢性肝病相关目标基因（JAG1、ATP8B1、GALT、MUT、MMAA、MARS和LARS等共249个基因）的全基因组文库，并对文库样本进行定量，保证文库样本总量在3μg以上。用液相捕获试剂盒（MyGenostics,中国）捕获目标基因，利用测序仪HiSeq2000（Illumina,美国）进行高通量测序，平均深度不小于200×。获取原始短序列，通过生物信息学分析单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）或插入/缺失（Indel），找出相关基因的突变信息。靶向外显?

构进行预测。2结果2.1SLC25A13基因突变分析和cDNA克隆分析结果SLC25A13基因高频突变筛查和测序分析仅检测到一个父源性的突变c.1658G>A。SLC25A13cDNA克隆分析结果显示，来自父源性的等位基因的克隆子共有7个，均含有点突变c.1658G>A；而来自母源性的等位基因的克隆子共有17个，但未发现异常的转录子，因此排除了希特林缺陷病导致的新生儿肝内胆汁淤积症。2.2外显子组捕获测序和Sanger测序结果代谢性肝病相关的249个基因外显子捕获测序检测到患儿LARS基因两个突变c.2133_2135del和c.1183G>A。Sanger测序结果（图2）证实，患儿为LARS基因c.2133_2135del和c.1183G>A突变的复合杂合子，前者来自父亲，后者来自母亲。2.3生物信息学分析结果突变c.1183G>A（p.D395N）和c.2133_2135del（p.L712del）在ExAC大数据库中的人群频率分别为0.005%和0.002%。比对包括人类、黑猩猩、狗、奶牛、大鼠、小鼠、鸡、热带爪蟾和线虫在内的9种真核生物物种之间的LeuRS同源蛋白序列，结果显示D395和L712均为保守氨基酸。两种突变的MutationTaster分析均>0.9999，PROVEAN分析的分数分别为-4.92和-13.23；PolyPhen-2分析错义突变c.1183G>A的分数为0.999，均提示此两种突变可能为致病性突变。进行蛋白结构预测时，p.D395野生型选取的蛋白结构模型为人胞质的亮氨酰-tRNA合成酶的编校结构域（2WFD，258-509位氨基酸），序列一致性为99.21%[15]。采用SWISS-PdbViewer4.1.0软件将p.D395野生型模型的第395位氨基酸由D变成N，突变后进行模型能量最小化，并比对两者构象的差异。第395位氨基酸由天冬氨酸变成天冬酰胺，使其附近氨基酸之间的氢键距离改变，同时伴有氢键生成和消失（图3）。由于2WFD不能覆盖L712，分析突变p.L712del的野生型和突?

第19卷第8期2017年8月中国当代儿科杂志ChinJContempPediatrVol.19No.8Aug.2017·918·2.4诊治经过与结局根据患儿病史、临床表现和实验室检查，考虑遗传性肝病导致的肝硬化。行SLC25A13基因突变分析和cDNA克隆分析，排除希特林缺陷玻但病因仍不明，未予特殊治疗。最终（3岁时）经代谢性肝病相关基因外显子组捕获二代测序和Sanger测序验证，确诊为LARS基因突变导致的ILFS1。目前随访至4岁，肝功能正常，但仍有低蛋白血症，无贫血，见表1；B超显示肝内回声较前改善。图3p.D395N突变前后空间结构预测图第395位氨基酸由天冬氨酸（A、B）变成天冬酰胺（C、D），使其附近氨基酸之间的氢键距离改变，同时伴有氢键生成和消失；T298和D399与附近氨基酸之间的氢键距离也受影响。绿色虚线表示氢键，相应数字表示氢键距离。图4p.L712del突变前后空间结构预测图A、B为野生型蛋白结构模型，C、D为突变后蛋白结构模型，第712位亮氨酸缺失破坏了709-713和753-755位氨基酸构成的β折叠结构，而位于第716-720位氨基酸的KMSKS模体与第155-164位氨基酸构成的α螺旋结构缠绕在一起（如C图箭头所示）。3讨论本研究患儿主要表现为肝脾肿大以及出生体重偏低、肝功能异常、低蛋白血症、贫血、凝血功能异常等，同时肝脏病理检查显示肝硬化和脂肪肝，这些表现均与希特林缺陷病的临床特点相似[17]。此外，SLC25A13基因检测还发现一杂合突变点c.1661G>A（p.R554Q），因此高度疑诊希特林缺陷玻然而外周血淋巴细胞SLC25A13cDNA克隆分析在另一个等位基因上没有发现异常的转录子，从而排除了希特林缺陷玻提示希特林缺陷病的诊断需要借助SLC25A13基因突变分析或mRNA分析等特异性手段[17-18]。该患者骨髓细胞学检查、病原体检查及自身免疫性
【参考文献】

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【共引文献】

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【二级参考文献】

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本文编号：2851292