哮喘儿童支气管肺泡灌洗液中miRNA表达的初步研究

发布时间：2020-10-26 18:51

　　 目的支气管哮喘(哮喘)是一种发病机制复杂的常见慢性呼吸道疾病,其发病率呈不断上升趋势,但其确切机制至今尚未完全清楚。微小RNA(microRNA,简称miRNA或miR)是一类长度约为22nt(核苷酸)的内源性非编码单链小RNA。研究发现,miRNA可以控制人类基因组中所有基因中的30%,并在各种生物过程中具有重要功能,包括细胞增殖分化及凋亡,机体代谢,组织损伤修复,生物发育等,从而参与哮喘等疾病的发生与发展,但miRNA中参与哮喘的具体种类及具体的信号机制尚不清楚。因此本实验主要研究哮喘儿童支气管肺泡灌洗液(BALF)中miRNA的表达水平并探讨可能的作用机制。方法2016年01月至2017年02月期间,收集确诊为哮喘患儿15例做为实验组,同时收集12例异物患儿(异物在24小时内移除)作为对照组。应用miRNA芯片检测miRNA的表达水平,并通过qRT-PCR验证其表达水平。并分别采用qPCR和酶联免疫吸附法(ELISA)方法,对于两组间表达差异较显著的miRNA家族(miR-34家族和miR-200家族)的预测靶基因E-钙粘蛋白(E-cadherin)的mRNA和蛋白质水平进行检测。结果1.在正常对照组患儿的支气管肺泡灌洗液中,发现存在超过800种miRNAs的表达,其中最丰富的 10 种 miRNAs 是 let-7b-5p、miR-191-5p、miR-23a-3p、miR-4454、miR-24-3p、miR-7704、let-7c-5p、let-miR-103a-3p 和 miR-3960。2.miRNA芯片检测发现,哮喘组患儿的支气管肺泡灌洗液中存在65种miRNAs与对照组有差异表达,包括43个下调的miRNAs和22个上调的miRNAs。下调的miRNAs中包含miR-34/449家族中的6种miRNAs和miR-200家族中的7种miRNAs,占所有下调miRNAs的30.2%。3.对miR-34/449家族和miR-200家族中的13种miRNA定量RT-PCR验证发现,miR-34/449家族中的4种和miR-200家族中的6种表达水平与miRNA芯片结果一致,包括 miR-34b-3p、miR-34b-5p、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-200a-3p、miR-200a-5p、miR-200b-3p、miR-200b-5p、miR-200c-3p 和 miR-141-3p。4.miR-34家族和miR-200家族的预测靶基因中E-cadherin基因,在两组间存在差异性表达,且其在哮喘儿童的支气管肺泡灌洗液中表达下调(P0.05)。结论miRNAs特别是miR-34和miR-200家族,参与了哮喘的发生,并可能通过调控靶基因E-cadherin的表达参与儿童哮喘的发病,这为哮喘的治疗提供了可能的治疗靶点或者新方向。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R725.6
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致谢
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中英文缩略词
1 前言
2 实验材料
    2.1 主要实验仪器
    2.2 主要实验试剂与材料
    2.3 PCR所需引物
3 实验方法
    3.1 研究对象
    3.2 纳入标准和剔除标准
    3.3 支气管肺泡灌洗液（BALF）的收集
    3.4 RNA抽提（TRIzol法）
    3.5 miRNA芯片
    3.6 PCR技术
    3.7 PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳
    3.8 蛋白浓度的测定
    3.9 统计学分析
4 实验结果
    4.1 对照组miRNA结果
    4.2 差异表达的miRNA
    4.3 差异表达miRNA的验证
    4.4 差异表达miRNA家族（2个家族）靶基因及信号通路的预测
    4.5 靶基因E-cadherin及其蛋白表达水平的测定
5 讨论
6 结论
7 不足与进一步展望
参考文献
综述
    参考文献
作者简历

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本文编号：2857384