酪酸梭菌改善自闭症谱系障碍小鼠肠道屏障功能和行为症状的机制研究

发布时间：2020-10-27 10:48

　　 第一部分自闭症谱系障碍儿童的肠道菌群变化及相关研究引言:自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)是一组神经发育障碍性疾病,核心症状为社会交往、语言沟通障碍以及重复或受限的行为、兴趣或活动。胃肠道症状(包括便秘、腹泻和胃肠胀气等)是ASD患者常见的伴随症状。ASD病因尚不明确,目前普遍认为遗传和环境因素均与其发病有关。大量研究表明,肠道菌群及其代谢产物(特别是短链脂肪酸,SCFAs)在ASD的发病机制中起着重要作用。然而,关于ASD儿童粪便短链脂肪酸的报道尚无一致结论;ASD儿童肠道菌群的结构及其与ASD儿童的行为症状、粪便SCFAs和胃肠道症状的关系仍未揭晓。目的:探索ASD儿童肠道菌群结构及其与粪便短链脂肪酸、行为症状严重程度和胃肠道症状之间的关系。材料与方法:1.分别纳入30名ASD儿童,20名健康对照儿童。2.应用改进的六项胃肠道严重程度指数问卷评估两组儿童的胃肠道症状。3.依据自闭症治疗评估表对ASD组儿童行为症状的严重程度进行评分。4.HPLC检测两组儿童粪便短链脂肪酸的含量。5.对两组儿童粪便细菌16S r RNA基因的V3-V4高变区进行测序,并分析其菌群组成及结构差异。6.应用Spearman相关系数分析肠道菌群与短链脂肪酸的相关性。7.应用Spearman相关系数分析肠道菌群与ASD组儿童行为症状严重程度的相关性。8.分析与ASD组儿童伴随胃肠道症状相关的菌群。结果:1.ASD组儿童与对照组儿童在年龄和性别上无统计学差异。2.ASD组儿童的便秘发生率显著高于对照组(P0.05)。两组儿童在腹泻,腹痛,粪便性状,粪便气味,胃肠胀气和胃肠道症状总评分上没有显著差异(P0.05)。3.ASD组儿童行为症状的评分分别为:语言(18.14±3.73),社交(27.83±3.84),感觉知觉(22.97±4.49)和健康/身体/行为(31.45±6.10)。4.与对照组儿童相比,ASD组儿童粪便中乙酸和丁酸含量降低,戊酸含量增高,差异具有统计学意义(P0.05)。5.ASD组儿童与对照组儿童肠道菌群结构与分布存在显著差异。与对照组儿童相比,ASD组儿童肠道菌群多样性和均匀度显著降低(P0.05)。在门水平,ASD组儿童粪便厚壁菌门比例较对照组显著降低,而酸杆菌门比例较对照组显著增高。在属水平,应用LEfSe分析两组儿童菌群各成分的丰度差异并筛选优势菌群,发现ASD组儿童粪便的优势菌群为Megamonas,Pseudomonas,Enterococcus和Acidobacteria等;而对照组儿童的优势菌群为Eubacterium,Peptostreptococcaceae,Streptococcaceae,Ruminococcaceae和Lachnospiraceae_NC2004_group等。6.Acidobacteria和Actinomycetaceae与粪便中戊酸水平呈正相关;Streptococcaceae,Peptostreptococcaceae,Lactobacillaceae和Clostridiaceae_1(ASD组儿童比例降低的菌群)与粪便中丁酸含量呈正相关。7.Megamonas与ASD组儿童健康/身体/行为评分和语言评分呈正相关(P0.05);Holdemanella与ASD组儿童感觉知觉评分呈正相关(P0.05)。8.便秘ASD组儿童较非便秘ASD组及对照组儿童粪便中Fusobacterium、Barnesiella、Coprobacter及戊酸正相关细菌(Actinomycetaceae)比例显著增高,产丁酸菌群比例显著降低。结论:便秘是本研究纳入的ASD组儿童伴随的唯一胃肠道症状。ASD组儿童粪便中乙酸和丁酸含量降低,戊酸含量增高。ASD组儿童与对照组儿童肠道菌群结构与分布存在显著差异,具体来说,ASD组儿童产丁酸菌群比例降低,戊酸正相关菌群比例升高。且ASD组儿童肠道菌群与行为症状的严重程度相关。ASD及其伴随便秘症状的发展可能与肠道内产丁酸菌群比例降低和产戊酸菌群比例增加相关。第二部分两种自闭症谱系障碍模型小鼠肠道菌群及肠道屏障功能的改变目的:探讨利用ASD的行为特征进行不同类型的小鼠建模时,是否会出现肠道菌群、肠道屏障功能及肠道动力的改变,为进一步研究微生态-肠-脑轴在ASD发病机制中的作用及益生菌对ASD的治疗作用提供理论基础。材料与方法:1.研究使用两种ASD小鼠模型,分别为基因突变鼠BTBR T~+Itpr3tf/JNju(BTBR组)和C57bl/6J雌鼠孕期腹腔注射丙戊酸钠造模(VPA组)。具体如下:C57bl/6J雌鼠和雄鼠交配,于孕12.5天皮下注射VPA或生理盐水。BTBR雌鼠与雄鼠交配。各组幼崽于3周断奶后,每窝随机选择2只雄鼠,纳入相应组别。部分小鼠于3周处死以评价3周龄ASD小鼠的肠道屏障功能改变。其余各组小鼠于6-10周进行行为学检测,检测结束后取小鼠粪便,之后处死小鼠,取结肠组织进行后续检测。2.3周龄小鼠肠道屏障功能检测:FITC-葡聚糖灌胃后光谱仪检测小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平;Western Blot检测各组小鼠结肠Trek1,claudin1,claudin3,occludin及ZO-1的表达;qPCR检测各组小鼠结肠IL-6,TNF-α和IFN-γ的表达。3.行为学检测:各组幼崽于出生后8天行超声检测幼崽发声情况,自第6周开始按如下顺序进行实验:旷场实验、埋珠实验、三室社交实验、发声检测和自我梳理实验。每次检测均间隔5天。4.评估小鼠肠道功能:粪便含水量及小肠推进率。5.对各组小鼠粪便细菌16S r RNA基因的V3-V4高变区进行测序,并分析其菌群组成及结构差异。6.HPLC检测各组小鼠粪便短链脂肪酸的含量。7.成年小鼠肠道屏障功能检测:FITC-葡聚糖灌胃后光谱仪检测小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平;Western Blot检测各组小鼠结肠Trek1,claudin1,claudin3,occludin及ZO-1的表达;qPCR检测各组小鼠结肠IL-6,TNF-α和IFN-γ的表达。结果:1.行为学检测结果:BTBR组幼鼠及VPA组幼鼠在20-50kHz和50-100kHz频率范围的发声次数及持续时间较对照组显著降低(P0.05)。与对照组相比,BTBR组成年小鼠及VPA组成年小鼠穿越旷场中间区次数及停留时间显著降低;于目标小鼠侧室的停留时间率显著降低(P0.05);埋珠率及自我梳理时间均显著升高(P0.05);在20-50kHz和50-100kHz频率范围的发声次数及持续时间均显著降低(P0.05)。2.3周龄小鼠肠道屏障功能:BTBR组及VPA组小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平均较对照组小鼠显著升高,结肠Trek1,claudin1,claudin3及occludin蛋白的表达较对照组降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。而BTBR组及VPA组小鼠结肠ZO-1的表达与对照组相比无显著差异(P0.05)。BTBR组小鼠结肠IL-6,TNF-α及IFN-γmRNA的表达较对照组显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与对照组相比,VPA组小鼠结肠IL-6和TNF-αmRNA的表达显著升高(P0.05);而IFN-γmRNA的表达则无明显差异(P0.05)。3.小鼠肠道功能:与对照组相比,BTBR组小鼠粪便含水量显著降低(P0.05);而VPA组小鼠粪便含水量与对照组相比无明显差异(P0.05)。BTBR组和VPA组小鼠小肠推进率与对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05)。4.菌群测序结果:BTBR组小鼠肠道菌群的sobs、chao、ace、shannon、shannoneven和simpsoneven指数值较对照组均降低,差异具有统计学意义(P0.05);而simpson指数值较对照组升高,差异具有统计学意义(P0.05)。VPA组小鼠肠道菌群的上述各指数值与对照组相比,均无显著差异(P0.05)。BTBR组、VPA组与对照组小鼠肠道菌群构成存在差异。在门水平:与对照组相比,BTBR组小鼠粪便Firmicutes和unclassified_K_norank比例显著升高,Bacteroidetes、Saccharibacteria和Spirochaetae比例显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);VPA组小鼠粪便Spirochaetae和Verrucomicrobia比例较对照组显著降低(P0.05)。5.粪便短链脂肪酸含量:BTBR组小鼠粪便中乙酸、丁酸和戊酸水平较对照组均显著降低(P0.05),丙酸水平无显著差异(P0.05)。与对照组相比,VPA组小鼠丙酸水平显著升高,丁酸水平显著降低(P0.05);乙酸及戊酸水平无显著差异(P0.05)。6.成年小鼠肠道屏障功能:BTBR小鼠及VPA小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平均较对照组小鼠升高,差异具有统计学意义(P0.05)。BTBR组及VPA组小鼠结肠Trek1、claudin1、claudin3及occludin蛋白的表达较对照组降低,结肠IL-6、TNF-α和IFN-γmRNA的表达较对照组显著升高,差异均具有统计学意义(P0.05);而BTBR组及VPA组小鼠结肠ZO-1的表达与对照组相比无统计学差异(P0.05)。结论:BTBR及VPA模型小鼠均表现出与ASD患者类似的广泛行为障碍,肠道菌群构成的改变及粪便丁酸水平的降低。BTBR小鼠及VPA模型小鼠在3周即表现出肠道Trek1及紧密连接蛋白表达下调,肠道屏障通透性及促炎细胞因子水平的增高;上述肠道改变在两种ASD模型小鼠成年期仍存在。第三部分酪酸梭菌改善自闭症谱系障碍小鼠的肠道屏障功能和行为症状目的:验证如下假说:在自闭症谱系障碍小鼠中,酪酸梭菌及其代谢产物丁酸能上调肠道Trek1及紧密连接蛋白的表达、降低促炎细胞因子的水平,改善肠道屏障功能,并减轻ASD行为症状。材料与方法:1.在第二部分BTBR及VPA自闭症谱系障碍小鼠模型的基础上进行酪酸梭菌灌胃处理。实验分5组:对照组、BTBR组、BTBR+酪酸梭菌处理组、丙戊酸钠组、丙戊酸钠+酪酸梭菌处理组。酪酸梭菌处理组小鼠3周断奶后给予0.5ml酪酸梭菌灌胃,连续21天;其余各组给予等体积生理盐水灌胃。灌胃结束5天后进行各项行为学检测,之后取小鼠粪便,处死小鼠并取结肠组织进行后续检测。2.行为学检测:按如下顺序进行实验:旷场实验、埋珠实验、三室社交实验、发声检测、自我梳理实验。每次检测均间隔5天。3.HPLC检测各组小鼠粪便中丁酸的含量。4.肠道通透性检测:FITC-葡聚糖灌胃后光谱仪检测小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平。5.Western Blot检测各组小鼠结肠Trek1,HDAC1,claudin1,claudin3及occludin的表达;qPCR检测小鼠结肠Trek1,HDAC1,claudin1,claudin3及occludin的表达;免疫组化检测各组小鼠结肠黏膜Trek1的表达。6.ELISA检测各组小鼠结肠IL-6,TNF-α和IFN-γ的水平。结果:1.BTBR组及VPA组小鼠粪便中酪酸梭菌水平极低,酪酸梭菌灌胃后,ASD模型小鼠的粪便酪酸梭菌和丁酸含量显著升高(P0.05)。2.BTBR+酪酸梭菌组小鼠及VPA+酪酸梭菌组小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平均较相应ASD组小鼠显著降低(P0.05)。3.WB结果显示:酪酸梭菌处理可以增加BTBR及VPA模型小鼠结肠Trek1、claudin1、claudin3及occludin蛋白的表达,降低HDAC1蛋白的表达,差异均具有统计学意义(P0.05)。qPCR及免疫组化的检测结果与WB相一致。4.BTBR+酪酸梭菌组小鼠及VPA+酪酸梭菌组小鼠结肠IL-6,TNF-α和IFN-γ水平较相应ASD组小鼠显著降低(P0.05)。5.行为学检测:酪酸梭菌处理能使BTBR和VPA模型小鼠穿越旷场中间区次数及停留时间显著升高;目标小鼠侧室的停留时间率显著升高;埋珠率和自我梳理时间显著降低;20-50kHz和50-100kHz频率范围的发声次数及持续时间显著升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:在两种ASD小鼠模型中,应用酪酸梭菌处理能抑制肠道HDAC1的表达,上调Trek1及紧密连接蛋白的表达、下调促炎细胞因子的水平,增强肠道屏障功能,并改善ASD样行为症状。第四部分酪酸梭菌通过Trek1调节自闭症谱系障碍小鼠肠道屏障功能目的:探索酪酸梭菌/丁酸钠对自闭症谱系障碍小鼠肠上皮屏障的作用靶点。材料与方法:1.C57bl/6J雄鼠随机分为两组,Con组和Con+spadin组。分别应用0.1ml生理盐水和spadin溶液对雄性C57bl/6J小鼠进行腹腔注射,每天1次,连续15天。结束后检测两组小鼠肠道屏障通透性。2.BTBR雄鼠在3周断奶后随机分为六组:BTBR组(Saline组)、BTBR+spadin组(SPA组)、BTBR+酪酸梭菌组(CB组)、BTBR+酪酸梭菌+spadin组(CB/SPA组)、BTBR+丁酸钠组(SB组)、BTBR+丁酸钠+spadin组(SB/SPA组)。酪酸梭菌处理组小鼠给予0.5ml酪酸梭菌悬液灌胃;丁酸钠处理组给予0.5ml丁酸钠灌胃,余各组小鼠给予等体积生理盐水灌胃。所有小鼠给予0.1ml spadin或等体积生理盐水腹腔注射。上述操作均每天1次,连续21天。3.肠道通透性检测:FITC-葡聚糖灌胃后光谱仪检测各组小鼠血清中FITC-葡聚糖的水平。4.肠道紧密连接蛋白:WB检测各组小鼠结肠claudin1,claudin3及occludin的表达。5.细胞因子检测:ELISA检测各组小鼠结肠IL-6,TNF-α和IFN-γ的水平。结果:1.对C57bl/6J小鼠进行spadin处理后,小鼠外周血中FITC-葡聚糖的水平显著升高(P0.05)。2.与CB组相比,CB/SPA组小鼠外周血中FITC-葡聚糖的水平显著升高;与SB组相比,SB/SPA组小鼠外周血中FITC-葡聚糖的水平显著升高,差异均有统计学意义(P0.05)。3.Spadin处理降低CB和SB治疗小鼠结肠claudin1、claudin3及occludin蛋白的表达量(P0.05)。4.CB/SPA组和SB/SPA组小鼠分别较CB组和SB组结肠IL-6,TNF-α的水平升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:Trek1是酪酸梭菌/丁酸改善ASD模型小鼠肠道屏障功能的作用靶点。结合本研究第三部分,在ASD小鼠模型中,酪酸梭菌/丁酸作为HDAC1抑制剂,通过上调肠道Trek1的表达,进而改善肠道屏障功能及ASD核心行为症状。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R749.94
【部分图文】：

3 2 0：*P<0.05 vs 对照组。SD 组儿童行为症状严重程度 ATEC 量表评估，ASD 组儿童行为症状的评分分别为：语言（18.14±27.83±3.84），感觉知觉（22.97±4.49）和健康/身体/行为（31.45±6童粪便 SCFA 含量LC 检测 SCFA 的混标图及标准曲线见附图 1.1 及附图 1.2。儿的含量见图 1.1。ASD 组儿童粪便乙酸水平（732.4±229.8）较±204.4，P=0.011）显著降低。两组儿童粪便中丙酸的水平没有统0.243）。与对照组儿童（563.3±186.7）相比，ASD 组儿童粪便丁酸（413.2±172.3，P=0.005）。而 ASD 组儿童粪便戊酸水平（1646.9±4于对照组儿童（615.8±221.0，P<0.001）。

图 1.2 ASD 和对照组儿童肠道菌群多样性a：OTU 水平 alpha 多样性 shannon 指数 b：OTU 水平 alpha 多样性 shannoneven 指数 c：OTU 水平 PCoA 分析（*P<0.05 vs 对照组）

图 1.2 ASD 和对照组儿童肠道菌群多样性平 alpha 多样性 shannon 指数 b：OTU 水平 alpha 多样性 shannonevOTU 水平 PCoA 分析（*P<0.05 vs 对照组）
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 吴梅荣;徐海青;;孤独症早期诊断生物学标记研究进展[J];中国儿童保健杂志;2015年09期

本文编号：2858420