二氢丹参酮Ⅰ作用于婴幼儿血管瘤的机制研究
发布时间：2020-10-31 14:03
目的:婴幼儿血管瘤(infantile hemangiomas,IH),为婴幼儿最常见的良性肿瘤之一,发病率约5%-10%。IH的发病机制至今模糊,约50%以上的患儿可自行消退,部分患儿在治疗后易出现色素沉着,同时伴有浅瘢痕、皮肤萎缩下垂等体征,严重者可能导致毁容,从而给患儿及家庭造成沉重的心理负担。激素和普萘洛尔是目前口服治疗IH的首要选择,两者在疗效显著的同时,也面临诸多副作用,因而更多有效的治疗手段仍需进一步探索。中医中药作为我国独有的医疗特色,具有巨大的潜在治疗价值,中药的有效成分研究为疾病的治疗提供了更多的可能性。传统医学中IH归属外科之“血瘤”,长于肌肤分肉之间,多因着经络阻滞,营卫不和、气血凝滞所致,当以活血化瘀为主,本研究拟从中医学理论出发结合现代药物化学,筛选具有活性的中药单体,为IH提供一种高效安全的治疗选择。我们在前期研究中选取萜类化合物进行筛查,发现丹参提取的化合物抑制血管瘤作用明显,随后对丹参中主要的化合物进行系统的分析,结果提示二氢丹参酮I(DHTS)在丹参提取的化合物中疗效最佳,体外细胞增殖实验(CCK8)提示DHTS抑制血管瘤细胞的能力为普萘洛尔的近二十倍,故本研究旨在进一步探索DHTS治疗婴幼儿血管瘤的作用机制,为临床的药物研发提供理论基础。方法:利用流式细胞术结合Hochest33258染色观察并探索DHTS对血管瘤细胞凋亡的影响,Western blot检测其对血管瘤细胞凋亡通路中经典蛋白的变化;采用血管成管实验,在相差显微镜下观察DHTS对血管瘤细胞血管生成的影响,并利用western blot检测是否对血管生成过程的关键蛋白VEGFR2及MMP9的表达有影响;进行裸鼠皮下移植瘤实验,成瘤后,对裸鼠进行腹腔药物注射,观察DHTS是否对体内血管瘤具有抑制增殖的作用,同时设立普萘洛尔对照组,比较两者的治疗效果。结果:体外实验结果提示,在DHTS作用于血管瘤细胞后,流式细胞技术提示其能显著引起血管瘤细胞早期凋亡,western blot提示DHTS在低浓度时更能诱发线粒体凋亡路径,高浓度时诱发Fas/Fasl凋亡途径;血管成管实验表明,DHTS能显著抑制血管瘤细胞血管生成,同时抑制血管生成过程中的关键蛋白-VEGFR2及MMP9的生成;体内裸鼠移植瘤的实验初步证明,DHTS能抑制体内血管瘤的增殖,免疫组化提示其抑制作用可能与诱导血管瘤细胞凋亡及抑制血管生成相关。结论:DHTS对婴幼儿血管瘤具有潜在的治疗作用,体外及体内实验初步表明,DHTS作用效果显著优于普萘洛尔,其作用机制可能是通过促进血管瘤细胞凋亡,抑制血管瘤血管生成的过程发挥作用。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R732.2
【部分图文】：
2.2 结果2.2.1 二氢丹参酮 I 与普萘洛尔对血管瘤细胞的增殖影响为了比较 DHTS 与普萘洛尔体外抑制血管瘤细胞的效率，我们采用 CCK8 体外细胞增殖实验进行研究，利用荷鼠自发的血管瘤细胞株（EOMA 细胞）为研究对象，分别用 0μM、0.37 μM、1.1μM、3.3μM、10μM 的 DHTS 及普萘洛尔进行处理，结果提示普萘洛尔在低浓度状态下对血管瘤细胞的抑制作用较微弱，遂改用 0 μM、3.7μM、11μM、33μM、100 μM 的浓度梯度进行处理。结果提示：DHTS 的 IC50为2.63±0.16 μM，而普萘洛尔的 IC50值为 53.67±0.16 μM，前者的作用强度几乎为后者的二十倍，普萘洛尔的浓度与文献的报道基本相符合[61]。故我们可认为 DHTS 在体外抑制血管瘤的作用显著强于普萘洛尔。在后续的研究中，为了更好的探索两者对血管瘤的作用机制，我们将选择半数抑制浓度作为研究浓度（图 2.1）
上海交通大学博士学位论文2.2.2 二氢丹参酮 I 与普萘洛尔对血管瘤细胞克隆形成的影响采用克隆形成实验来检测 DHTS 及普萘洛尔对血管瘤细胞的抗增殖作用。消化EOMA 细胞后，细胞计数，制成单细胞悬液，按照 500 个/2ml 细胞接种至 6 孔板，分为 DMSO 组、DHTS 及普萘洛尔处理组，每组设 3 个复孔。一周后进行细胞固定染色后观察细胞克隆形成。结果显示，DMSO 对照组（control）较处理组细胞克隆形成数目增多，效果明显，如图 2.2。表明 DHTS 及普萘洛尔抑制 EOMA 细胞的增殖及成瘤能力。
图2.3 EOMA细胞被DHTS及propranolol处理后细胞形态学的变化。Figure 2.3 EOMA morphological characteristics changed by DHTS and propranolol treatmA:为空白对照组。B-C:为 2.5 μM及5 μM DHTS处理EOMA细胞24h，细胞形态的变化为50 μM及100μM propranolol处理EOMA细胞24 h，细胞形态的变化。其共同的特点殖速度减慢，形态发生相应的变化：胞体变圆，细胞突起变短，胞浆内产生较多颗
【参考文献】
本文编号：2864041
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R732.2
【部分图文】：
2.2 结果2.2.1 二氢丹参酮 I 与普萘洛尔对血管瘤细胞的增殖影响为了比较 DHTS 与普萘洛尔体外抑制血管瘤细胞的效率，我们采用 CCK8 体外细胞增殖实验进行研究，利用荷鼠自发的血管瘤细胞株（EOMA 细胞）为研究对象，分别用 0μM、0.37 μM、1.1μM、3.3μM、10μM 的 DHTS 及普萘洛尔进行处理，结果提示普萘洛尔在低浓度状态下对血管瘤细胞的抑制作用较微弱，遂改用 0 μM、3.7μM、11μM、33μM、100 μM 的浓度梯度进行处理。结果提示：DHTS 的 IC50为2.63±0.16 μM，而普萘洛尔的 IC50值为 53.67±0.16 μM，前者的作用强度几乎为后者的二十倍，普萘洛尔的浓度与文献的报道基本相符合[61]。故我们可认为 DHTS 在体外抑制血管瘤的作用显著强于普萘洛尔。在后续的研究中，为了更好的探索两者对血管瘤的作用机制，我们将选择半数抑制浓度作为研究浓度（图 2.1）
上海交通大学博士学位论文2.2.2 二氢丹参酮 I 与普萘洛尔对血管瘤细胞克隆形成的影响采用克隆形成实验来检测 DHTS 及普萘洛尔对血管瘤细胞的抗增殖作用。消化EOMA 细胞后，细胞计数，制成单细胞悬液，按照 500 个/2ml 细胞接种至 6 孔板，分为 DMSO 组、DHTS 及普萘洛尔处理组，每组设 3 个复孔。一周后进行细胞固定染色后观察细胞克隆形成。结果显示，DMSO 对照组（control）较处理组细胞克隆形成数目增多，效果明显，如图 2.2。表明 DHTS 及普萘洛尔抑制 EOMA 细胞的增殖及成瘤能力。
图2.3 EOMA细胞被DHTS及propranolol处理后细胞形态学的变化。Figure 2.3 EOMA morphological characteristics changed by DHTS and propranolol treatmA:为空白对照组。B-C:为 2.5 μM及5 μM DHTS处理EOMA细胞24h，细胞形态的变化为50 μM及100μM propranolol处理EOMA细胞24 h，细胞形态的变化。其共同的特点殖速度减慢，形态发生相应的变化：胞体变圆，细胞突起变短，胞浆内产生较多颗
【参考文献】
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