川崎病(Kawasaki Disease,KD)是一种儿童期较常见的发热、出疹性疾病,主要病理特征是全身中小血管炎症。近年来,该病的发病率呈逐年上升趋势,成为目前儿童后天性心脏病的首位病因。尽管川崎病日益受到重视,但川崎病的的病因和发病机制尚未阐明。深入探讨川崎病状态下的器官损伤机制,寻找针对性的治疗策略仍是亟待解决的重要问题。我们在临床观察中逐步注意到,除了急性发热、出疹等主要诊断标准中的临床表现之外,川崎病导致的重要器官损伤和功能减退不容忽视。心、肺功能对生命体至关重要,川崎病状态下可累及心脏功能和肺血管功能损伤,但川崎病致心肌损伤和肺血管重构的生物学机制并不十分清楚。以往研究显示,异常的炎症反应在川崎病发病过程中发挥重要作用。因此,川崎病状态下炎症因子的作用和机制理应成为关注的重点。脂质运载蛋白-2(lipocalin-2,Lcn 2)是一种由脂肪组织、中性粒细胞、巨噬细胞等分泌的细胞因子,它可以作为炎症介导的启动因子。新近发现,在一些恶性疾病中Lcn 2水平变化对细胞生存有重要影响,与心、肺器官损伤程度具有相关性。更为重要的是,针对不同类型的细胞,Lcn 2具有促进或者抑制细胞凋亡的不同生物学效应。目前,关于Lcn 2在川崎病相关心肌损伤和肺血管重构中的作用和机制尚属未知。为深入探讨川崎病相关心肌损伤和肺血管重构的生物学机制,本研究采用川崎病大鼠模型,从体内和体外实验分析Lcn 2是否参与川崎病状态下心、肺损伤的病理生理过程并阐明潜在的信号机制。本课题进行了两部分的研究工作。第一部分川崎病诱发肺血管重构的实验研究近年来有临床病例报道,部分川崎病患者合并肺动脉高压,出现肺动脉扩张、右心室压力升高等临床表现。而且,部分因冠状动脉瘤猝死的川崎病患者尸检时发现肺血管被广泛累及,肺动脉也存在狭窄、肥厚等病理性的结构改变,提示川崎病能够累及到肺动脉,引起肺动脉结构和功能的改变。目的:探讨Lcn 2在川崎病诱发肺血管重构过程中的作用和潜在机制。方法:采用干酪乳杆菌细胞壁提取物(LCWE)腹腔内注射建立川崎病大鼠模型;组织形态学检测肺动脉结构的病理改变;ELISA法检测循环水平和肺组织匀浆中Lcn 2的含量;血流动力学检测平均左颈总动脉压(m CAP)及右心室收缩压(RVSP)。体外实验采用原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)和中性粒细胞(PMNs),ELISA法检测Lcn 2的含量,并进一步采用Western blotting和RT-PCR检测分析相关蛋白和m RNA水平。结果:1.川崎病大鼠出现右心室压升高和肺小动脉重构。1月龄SD大鼠(体重80~100g)腹腔注射LCWE 0.5ml(1mg/ml)14天后,肺组织出现水肿和局部点、片状出血,大量中性粒细胞为主伴有少量淋巴细胞和单核细胞浸润。虽然各组大鼠的m CAP无明显改变,但是RVSP升高,右心肥厚指数[RV/(LV+S)]%显著增加。至28天后,发现局灶性肺不张和肺气肿,肺小动脉内皮细胞肿胀。镜下观察肺小动脉中膜增厚,管腔狭窄。组织学提示肺动脉平滑肌层增厚。结果提示,川崎病动物出现肺循环阻力的升高、右心结构改变,同时伴有肺动脉炎症细胞浸润、平滑肌层增厚、血管管腔狭窄等肺动脉重构的表现。2.川崎病大鼠肺动脉组织出现促增生性内质网应激(ER stress)。内质网应激与肺动脉高压和平滑肌层增厚关系密切。我们的实验发现:川崎病状态下肺动脉组织中,ER stress相关促增生蛋白ATF6裂解(60 k D)较对照组升高,显著增加ATF6核转位,进而升高GRP78和NOGO的m RNA和蛋白水平。另一方面,ER stress相关促凋亡蛋白CHOP表达以及核转位未发生明显变化,促凋亡蛋白Caspase 12的表达未见升高。3.川崎病大鼠血浆和肺组织中Lcn 2水平显著升高。与对照组相比,LCWE注射后14天,川崎病大鼠血浆和肺组织匀浆中Lcn 2含量达高峰,并维持较高水平。通过体外实验对比发现,LCWE刺激后增多的Lcn 2可能来源于循环中或者肺组织中的PMNs。4.Lcn 2促肺动脉平滑肌细胞增生。上述结果明确:川崎病的肺动脉组织增生性反应同时伴有Lcn 2升高。我们进一步观察Lcn 2是否导致肺动脉平滑肌细胞增生。细胞学实验发现,Lcn 2处理PASMCs可直接导致ATF6裂解和核转位,GRP78和NOGO表达显著增高;反之,促凋亡的CHOP和Caspase 12水平未见升高。检测细胞增殖率发现Lcn 2处理显著促进PASMCs增殖。上述结果表明,Lcn 2在肺动脉平滑肌细胞增生性转变中发挥重要作用。5.抑制增生性内质网应激改善川崎病大鼠肺血管重构。为了寻找针对性的防治措施,我们对川崎病大鼠采用内质网应激的特异性抑制剂PBA治疗。细胞学实验发现1m M PBA处理能够显著抑制Lcn 2引起的PASMCs增殖。整体动物实验证实1月龄大鼠在注射LCWE后给予PBA(500 mg/kg)治疗14天,可有效降低RVSP和右心肥厚,有效抑制肺小血管的结构改变。结论:本研究证实:川崎病状态下可诱发肺血管重构和肺动脉平滑肌细胞增殖同时伴有Lcn 2显著升高。Lcn 2诱导的促增生性内质网应激在肺动脉平滑肌细胞增生性转变中发挥重要作用。针对性的抑制ER stress是防治川崎病相关肺血管损伤的有效措施。第二部分川崎病致心肌损伤的实验研究除了血管炎性损伤外,川崎病是否存在直接的心肌损伤,目前仍缺乏系统的实验研究。有研究显示Lcn 2作为重要的炎症分子,与心肌细胞和血管内皮细胞损伤、细胞凋亡等密切相关,参与心血管疾病的发生发展。我们在第一部分的研究中发现川崎病状态下血浆中Lcn 2水平显著升高,由此促使我们进一步探讨川崎病诱发心肌损伤,并分析Lcn 2在此过程中的作用。目的:探讨Lcn 2在川崎病诱发损伤中的作用和潜在机制。方法:建立川崎病大鼠模型(方法同第一部分);ELISA法检测川崎病大鼠血浆、心肌组织匀浆中以及临床川崎病患者血浆中Lcn 2的含量;心脏超声检测大鼠心脏收缩舒张功能;Masson染色,评估心肌纤维化的程度;荧光实时定量PCR法检测心肌组织中IL-6、CD3、CD45和Collagen I的m RNA表达;Western blotting方法检测心肌组织中Caspase 3、CHOP、ATF6、p-PERK、p-el F2α和Caspase 12等蛋白的表达。结果:1.川崎病诱发心脏收缩舒张功能障碍和炎症反应。采用心脏超声检查证实:与对照组相比,川崎病大鼠心脏左室舒张末期内径(LVIDd)增加,左室射血分数(LVEF)降低(P0.05)。该结果提示,川崎病状态下心脏发生扩张并出现泵血能力下降。Masson染色显示川崎病大鼠心肌出现一定程度心肌纤维化和胶原沉积。心肌中的IL-6、CD3和CD45等炎症相关分子的m RNA表达水平显著升高(P0.05)。2.川崎病状态下心脏组织和循环水平Lcn 2升高。我们进一步发现,川崎病状态下大鼠血浆中Lcn 2的含量逐步升高,于建模7天出现统计学差异。至14天达到峰值,并维持较高水平于28天以上。建模28天后,取心肌组织匀浆检测同样证实川崎病大鼠心肌组织中Lcn 2水平较对照组显著升高(P0.05)。更为重要的是,临床血浆样本也证实,川崎病患者循环水平的Lcn 2较正常对照组出现升高(n=6,P0.05)。3.Lcn 2促胶原形成。为明确Lcn 2是否参与了心肌胶原纤维沉积。我们采用培养的心肌成纤维细胞,给予Lcn 2(10 ng/ml)处理48小时。结果发现Collagen I的m RNA和蛋白表达水平均升高(P0.05)。并且发现,Lcn 2处理可显著上调心肌成纤维细胞NF-кB和IкB的磷酸化水平。采用IкB的抑制剂BAY 11-7082(2.5μmol/L)处理可有效抑制Lcn 2对Collagen I蛋白的上调作用。上述结果表明:Lcn 2可能通过激活NF-кB信号促胶原的形成。4.Lcn 2诱导心肌细胞促凋亡性内质网应激(ER stress)。除了成纤维细胞,我们进一步探讨Lcn 2对心肌细胞的直接作用。我们采用原代培养的心肌细胞,给予Lcn2(10 ng/ml)处理48小时。结果发现:Lcn 2诱导心肌细胞出现凋亡。ER stress的标志物ATF6、CHOP、p-PERK、p-el F2α均出现升高,导致凋亡信号Caspase 12和cleave-Caspase 3水平显著增高。定量检测心肌细胞Caspase 3活性显著增高(P0.05)。上述结果表明,与成纤维细胞所不同的是,Lcn 2对心肌细胞的直接作用为诱发内质网应激导致心肌凋亡。5.抑制内质网应激缓解川崎病大鼠心肌细胞凋亡改善心脏功能。在明确了Lcn 2诱导心肌细胞促凋亡性内质网应激的作用基础上,我们采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)处理(500mg/kg,灌胃,每天一次,持续14天)。结果发现:PBA处理有效抑制川崎病状态下的心肌内质网应激程度,降低ATF6、CHOP、p-PERK、p-el F2α水平,降低Caspase 12和cleave-Caspase 3水平(P0.05)。TUNEL结果证实,抑制内质网应激可有效降低川崎病大鼠心肌细胞凋亡,并最终改善川崎病大鼠舒张功能。结论:本研究证实:川崎病状态下可诱发心肌成纤维细胞胶原合成增加和炎症反应,同时伴有Lcn 2显著升高。我们发现Lcn 2对心肌细胞的直接作用是促凋亡性内质网应激。抑制川崎病状态下的心肌内质网应激可抑制心肌凋亡改善心脏功能。总结:本系列研究明确发现Lcn 2在川崎病相关心功能损伤和肺血管损伤过程中起重要作用。针对不同类型的细胞(可增殖的肺动脉平滑肌细胞,不增殖的心肌细胞),Lcn 2具有促增生或者促凋亡的不同生物学效应;Lcn 2触发内质网应激是上述生物学现象的主要细胞机制。上述机制共同导致了心肌损伤和肺动脉重构在川崎病状态下共存。由于目前,尚没有成熟可行的Lcn 2干预手段(例如中和抗体),抑制川崎病状态下的内质网应激可能是防治川崎病相关心肌损伤和肺动脉重构的可行途径。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R725.4
【部分图文】：
同时反映右心肥厚的指标[RV/ (LV+S)]%也有明显的增加（图 1.1 C，P < 0.05）。HE 染色后观察（图1.1 D），对照组大鼠（Con 组）的肺组织结构基本正常，肺小动脉管腔大小正常，内膜平整，肌层无增厚。而 LCWE 7 d 组可见肺组织炎细胞浸润，渗出，肺小动脉壁厚度轻度增加，平滑肌层出现不规则阶段性肥厚。LCWE 14 d 组的肺小动脉壁层和平滑肌层出现更明显的增厚。LCWE 21 d 组可见肺组织出现水肿和局部点、片状出血，大量中性粒细胞为主伴有少量淋巴细胞和单核细胞浸润。肺泡间隔明显增厚，肺泡腔缩小，发现局灶性肺不张和肺气肿，肺小动脉内皮细胞出现肿胀，肺小动脉中膜厚度增加，平滑肌层出现不规则间断性肥厚，管腔明显狭窄。LCWE 28 d 组的肺小动脉管腔几乎闭塞。代表肺小动脉增厚的指标 WA %和 WT %均显著增加（图1.1 E 和 F，P < 0.05）。我们又进行了肺小动脉的 PCNA 染色，以评估肺小动脉增殖的情况。结果显示，LCWE 注射 28 天，大鼠表现为肺小动脉平滑肌明显增厚，管腔明显狭窄，镜下增殖的平滑肌细胞核呈棕黄色，PCNA 表达较对照组明显增加（图 1.1 G 和 H
-60图 1.2 川崎病大鼠肺小动脉促增生性内质网应激分离川崎病大鼠 1~3 级肺小动脉，提取肺小动脉蛋白和 mRNA，检测相关内质网应激标志物的表达情况。（A） 肺小动脉相关内质网应激标志物表达；（B）细胞核内 ATF6 和 CHOP 的表达变化；（C）肺小动脉组织中 GRP78 和 NOGO 的 mRNA表达变化。与对照组相比较，* P < 0.05, n=8。Figure.1. 2. Kawasaki disease rat pulmonary arteries promote proliferativeendoplasmic reticulum stressIsolation of 1 to 3 pulmonary arterioles from Kawasaki disease rats to extract pulmonaryarterial proteins and mRNA, and to detect the expression of related endoplasmicreticulum stress markers. (A) Pulmonary arteriolar-associated endoplasmic reticulum
Lcn 2 水平达高峰，并且持续保持高水平至 28 天以上（图1.3A 和 B，P < 0.05）。肺组织中 Lcn 2 蛋白表达水平也呈同样的趋势变化（图 1.3C，与对照组相比，P < 0.05），表明川崎病大鼠血浆中和肺组织匀浆中可溶性 Lcn 2 的含量显著性增加，肺组织中 Lcn 2 的蛋白表达也一直在保持较高的水平。3.4 川崎病状态下 Lcn 2 的来源分析在明确了川崎病状态下 Lcn 2 出现升高之后，我们初步分析 Lcn 2 可能的细胞来源，采用 LCWE 分别处理 PASMCs 细胞和 PMNs 细胞，进行差异分析。原代培养的 PASMCs 加入不同浓度的 LCWE（0.1~20 μg/ml）后检测细胞上清液中 Lcn 2 的含量
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本文编号：
2865691
