培养心肌细胞感染病毒后电压门控钾离子通道表达的改变及芦丁作用的研究

发布时间：2020-11-11 17:07

　　 病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是儿科临床常见的心血管系统疾病之一，其临床表现各异，在急性期，轻者可以没有症状，重者可发生心力衰竭、心源性休克、室性快速性心律失常，甚至猝死，部分迁延不愈者会最终演变成扩张性心肌病，严重威胁身体健康。二十世纪七十年代以来，VMC的发病日趋增多，国内外许多学者以柯萨奇B组病毒(Coxsackieviruses group B，CVB)建立了VMC的动物模型或细胞模型，从免疫反应、细胞凋亡等方面探讨VMC的发病机制，但其发病机制尚未完全阐明，故研究其发病机理，为临床治疗提供理论依据是当前心血管科研工作者研究的热点。 VMC的发病机制比较复杂，目前比较明确的是病毒对心肌细胞的直接损伤作用和机体感染病毒后所产生的免疫反应对心肌细胞的杀伤作用。但其确切的机制尚未完全阐明。有研究表明病毒对心肌细胞离子通道的作用可能参与和／或加重病毒对心肌细胞的损伤。钾离子通道在所有离子通道中占据重要地位，它在遗传上或功能上都具有多样性，在维持膜静息电位，膜兴奋性以及膜复极化速率等方面起着关键性的作用，已成为心血管疾病医学研究的热门课题和医药发展的主攻方向。近年来国内外研究表明，在心肌梗塞后、高血压性肥大心肌及慢性心力衰竭或慢性心律失常等成人多见疾病中钾离子通道基因的mRNA水平发生了改变，但对其在病毒性心肌炎中的改变尚未见报道。 浙三工大学博士学位论文 寻找治疗VMC的有效药物一直是临床工作人员和科研工作者的关注点。国 内研究表明，多种中草药在病毒性心肌炎的治疗中取得较好的效果，特别对心肌 炎的慢性阶段有良好的疗效。近年来的研究表明:芦丁可明显抑制胞膜脂质氧化 酶，有效地保护心肌细胞膜的完整性，从而对缺糖缺氧和缺血后再灌注损伤的心 肌细胞有良好的保护作用。但迄今尚未见有关芦丁是否对病毒感染的心肌细胞有 保护作用及其相关机理的报道。 本研究选用体外培养的新生SD大鼠心肌细胞，建立嗜心性CVB(my。carditiC CvB3，CvBam)感染心肌细胞的模型，观察病毒感染后心肌细胞形态结构的变化、 培养上清中钾离子浓度改变及心肌细胞膜上电压门控钾离子通道Kvl .2、Kvl .5、 Kv2.1、Kv4.2基因的mRNA水平和Kvl.5、Kv4.2蛋白水平的改变，以芦丁千预 后，观察这些指标的相应改变，从离子通道的角度来探讨VMC的发病机理、心律 失常发生机制和芦丁的作用机制。 第一部分SD大鼠乳鼠心肌细胞培养、 病毒性心肌炎模型的建立 用分步胰酶消化法获取SD大鼠乳鼠的心肌细胞，采用差速贴壁法和BrdU 抑制法提纯心肌细胞。在心肌细胞培养满48小时后，随机把细胞分成二组:正 常对照组和病毒感染组。在病毒感染组中添加含ZooTeIDS。CVB3。的RpMll640培 养基，对照组仅加培养基，37℃温育2小时后，各组弃上清，以Hank’S液冲洗 后加培养基，置37℃培养观察，每2一3天换液，观察心肌细胞的形态结构，并 分别在病毒感染后24小时、72小时、120小时抽取上清送检心肌酶AST、LDH、 CK一MB。 结果 1.倒置显微镜下细胞形态、搏动的观察:孵育24小时时乳鼠心肌细胞均已 贴壁，呈梭形，有少量分叉，折光性强，细胞之间没有完全融合，细胞开始出现 缓慢小幅搏动，孵育48小时后心肌细胞折光性更强，分叉增多，融合成团，呈 菊花状，100%心肌细胞以40~120次/分钟的频率搏动，同团细胞为同步搏动， 浙会工大学博士学位论文 非同团细胞绝大多数为同步搏动，有个别为非同步搏动。病毒感染后48小时内 心肌细胞的外形无明显改变，但搏动频率有所下降，并出现非同步搏动增多，至 72小时后，感染细胞搏动明显减少甚至停止搏动，出现病变细胞:折光性下降， 细胞变圆，变暗，成团，破坏，可发现影子细胞(ghos七cen)(细胞体积明显 增大，内容物减少，细胞核未见)，CPE在(+)~(+++)之间，至120小时， 非感染细胞仍同步搏动，而感染细胞几乎全部停止搏动，细胞灰暗，成团，细胞 间隙增宽，培养上清中漂浮物增多。 2.病毒感染后细胞培养上清中心肌酶AST、LDH、CK一MB的变化:病毒感染 24小时，培养上清中心肌酶AST、LDH、CK一MB水平在对照组与感染组之间均没 有显著性差异(P0.05)，在72小时、120小时，感染组的心肌酶AST、LDH、CK一MB 水平均升高，与对照组比较有显著(P0.05)或极显著差异(Pq.01)o各组在 72小时、120小时时间点与本组24小时时间点进行配对T检验，对照组心肌酶 AST、CK一MB没有显著改变(P)0.05)，LDH有极显著降低(P(0.01);感染组各心 肌酶则均有极显著升高(P0.01)。 第二部分培养心肌细胞感染病毒后电压门控钾离子通道表达的改变 同第一部分培养心肌细胞和建立心肌细胞病毒感染模型后，在病毒感染24 小时、72小时、120小时点各抽取培养上清lml送检上清中K+，在120小时点 终止细胞培养，抽取细胞的总RNA和细胞膜总蛋白，分别用RT一PcR和Western blotting法钡(定心肌细胞的电压门控钾离子通道Kvl.2、Kvl.5、Kv2.1、Kv4.2的 mRNA和Kvl.5、Kv4.2的蛋白水平。 结果 1.病毒感染后培养上清中I{+的变化:病毒感染组在病
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2004
【中图分类】：R725.4
【部分图文】：

RT-PCR法测定钾浦遣&v1.2,Rv1.5;%v2.1,%v4.2的.味目石水平儿naxkerC:对照组I:感染组

ITKVZ.l图3一122、K节1。5、:感染组KVZ.1、KV4。2K诚.枷F】万A的影响T:千预组巧kD，呻吟味份州甲扮一神呼护甲C1TC1TCIT图3一14芦丁对心肌细胞钾离子通道Kvl.5蛋白的影响c:对照组工:感染组T:治疗组7。勺.甘劝目皿可卜匆台，.口CITCIT图3一巧芦丁对心肌细胞钾离子通道Kv生.2蛋白的影响C:对照组工:感染组T:治疗组

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本文编号：2879483