广东人群葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）基因突变研究

发布时间：2020-11-12 04:09

　　葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症(Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency)简称G6PD缺乏症,是由于G6PD基因突变,酶活性降低所导致的溶血性疾病,属X连锁不完全显性遗传。G6PD缺乏症新生儿高胆红素血症发病率高,黄疸程度重者可导致新生儿胆红素脑病,造成永久性神经系统损伤,甚至引致死亡。因此早期诊断和治疗十分重要。G6PD缺乏症是世界上最常见的单基因遗传病之一,世界范围内约有4亿人受累,我国以广东及广西发生率最高。迄今为止,我国人群中至少有25种G6PD突变型,其中1376GT、1388GA和95AG这三种突变占60-72%以上。基因突变的研究对实现产前诊断和基因诊断,预测患儿的临床表型和治疗疗效评估具有非常重要的作用。目的:通过对50例广东籍G6PD缺乏症患者进行基因突变分析,了解两种常见突变类型G6PD Canton(1376GT)、G6PD Kaiping(1388GA)和两种少见的突变类型(1311CT、IVS93 TC)的发生频率,探讨突变位点之间的相互作用及基因突变类型与新生儿高胆红素血症临床特点之间的关系,了解广东人群G6PD基因突变特点,深入探讨该病的发病机理,为临床诊治提供科学依据。对象与方法:选择2007年入院50例广东籍G6PD缺乏症新生儿为实验组,20例黄疸新生儿为对照组,提取外周静脉血基因组DNA。应用PCR-DNA直接测序法检测G6PD Canton(1376GT)和1311CT、IVS93 TC突变类型,应用突变特异性扩增系统(ARMS)法检测G6PD Kaiping(1388GA)突变类型,了解4种基因点突变的发生频率。分析4种G6PD突变类型各项相关临床指标与对照组的差异。结果:在50例实验组样品中,检测出G6PD突变类型4种:1388GA、1376GT、1311CT和Intron11 93位点TC。检测出1388GA突变类型30例(60.0%),1376GT突变类型13例(26.0%),1311CT 2例、IVS 93TC 2例。其中G6PD 1388GA/1376GT复合突变6例, 1311CT/IVS 93TC复合突变2例(1388GA/1311CT/IVS 93TC复合突变1例,1376GT/1311CT/IVS 93TC复合突变1例)。在20例对照组中检测出1388GA突变类型1例。3种G6PD基因突变型(1388GA、1376GT、1388GA/1376GT)男/女性别比、血清总胆红素峰值、MetHb%、G6PD/6PGD与对照组统计学上差异有显著性意义,3种G6PD基因突变型之间男/女性别比、血清总胆红素峰值、MetHb%、G6PD/6PGD统计学上差异无显著性意义。3种G6PD基因突变型与对照组及3种G6PD基因突变型之间在黄疸出现日龄方面统计学上差异无显著性意义。G6PD1376GT组、1388GA/1376GT组与对照组、1388GA组与1388GA/1376GT组之间黄疸消退日龄统计学上差异有显著性意义。G6PD1388GA组与对照组,1376GT与1388GA组,1376GT与1388GA/1376GT组组间黄疸消退日龄统计学上差异无显著性意义。1388GA组与对照组,1376GT与1388GA组血红蛋白值统计学上差异有显著性意义,1376GT、1388GA/1376GT组与对照组, 1376GT组, 1388GA组与1388GA/1376GT复合突变组之间血红蛋白值统计学上差异无显著性意义。3种G6PD基因突变型之间在蓝光照射和使用白蛋白方面差异在统计学上无显著性意义。结论: 1、1388GA与1376GT是广东人群中最常见的两种G6PD基因突变类型。其突变类型发生频率分别为60.0%和26.0%。 2、G6PD基因存在复合突变,其中1388GA/1311CT/IVS 93TC与1376G T/1311CT/IVS 93TC国内外未见报道。 3、女性杂合子具有不同的表现度,可能表现为酶活性正常。 4、G6PD缺乏症是新生儿高胆红素血症的高危因素之一,但不是造成新生儿黄疸过早出现的高危因素。复合突变与单个点突变在黄疸程度方面差异无显著性。
【学位单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2010
【中图分类】：R722.1
【部分图文】：

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12图 1 1376 和 1388 位点位点在人类 G6PD 基因 DNA 序列中的位置（方框所示）2) 设计引物的位置：根据人类 G6PD DNA 的序列设计 1376 位点的引物， 1388 位点引物设计参考文献[7]。3) 设计引物的原则：引物长度以 15～30bp 为宜；引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在 45～55％左右；引物内部避免形成二级结构，尤其在 3′末端不应有互补链存在；引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性；引物 3′末端碱基严格互补，末位碱基尽量不选 A；5′末端碱基没有严格的限制。4) 应用 Oligo6.0 软件分析设计的引物：需要分析的指标：二聚体结构、发夹结构、

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2 ) PCR 产物进行水平式琼脂糖凝胶电泳①配胶：称取 0.4G 的琼脂糖凝胶倒入三角杯中，加入 1×TAE 缓冲液 20ml，配制成浓度为 2%的凝胶，加热 30 秒。②倒胶：将凝胶冷至 60℃左右时，在凝胶中加入 EB 至终浓度为 0.5μg/ml，摇匀后缓缓倒入已插好梳子的制胶膜中。凝胶厚度为 3～5mm，避免产生气泡。③凝胶条件：凝胶在室温下放置 20 分钟。④加电泳缓冲液：凝胶完全凝固后，移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入 1×TAE的电泳缓冲液，液面高出凝胶表面 1mm。⑤加样：取 5μlPCR 产物加入 10×LOADING BUFFER 混合均匀，加至加样孔中，以 100bp DNALadder Marker 做对照，鉴定条带。⑥电泳：90V 电压电泳 30－40 分钟。⑦在紫外灯下观察 DNA 条带的迁移位置并拍照。（照片如图 2）⑧显示清晰的 1376 位点条带者，进一步行 DNA 条带直接测序。

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