内皮祖细胞Notch4信号通路在川崎病模型冠脉损伤及修复中作用的研究

发布时间：2017-05-18 11:15

  本文关键词：内皮祖细胞Notch4信号通路在川崎病模型冠脉损伤及修复中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 川崎病(Kawasaki disease),是一种自限性全身血管炎性综合征,为5岁以下婴幼儿的急性发热出疹性疾病,属于自身免疫炎症性疾病。由日本儿科医师Tomisaku Kawasaki在1967年首先报道,开始以为是罕见疾病,但目前川崎病已取代风湿热成为许多国家(亚裔国家多见)婴幼儿和儿童获得性心脏病的首要病因,也是我国常见的成人心血管疾病的病因之一。病程中内皮细胞坏死、脱落可以导致血管内膜受损、平滑肌层和胶原暴露、血小板凝聚,上述病理过程进而加重了炎症反应,使血管壁结构完整性被破坏,最终致冠脉狭窄或阻塞,甚至冠状动脉瘤。 内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞,能够在内源性或(和)外源性刺激因素作用下促进内皮修复和血管新生,能够维持血管内皮完整性,从而维持血流动力学的稳定。组织缺血缺氧或内皮损伤时,骨髓EPCs被动员至外周血,通过增殖、迁移、归巢、分化整合至内皮缺损部位,参与血管损伤的修复以及微血管生成过程。促进EPCs的增殖、动员及分化,增加外周血循环EPCs的数量,将是冠状动脉损伤治疗的新方向。而目前关于内皮祖细胞的定义,生物学特性,动员、迁移、归巢及分化的具体过程及详细机制都不甚清楚或者存在很大争议。 Notch4信号介导的细胞间通讯在心血管发育及修复过程中有重要作用,Notch4信号通路是维持造血干细胞以及EPCs等细胞未分化状态的关键。EPCs表面存在Notch4受体,与相应配体结合后能够促进EPCs增殖、分化及动静脉转化等过程,在血管生成与修复中起重要调控作用,因此Notch4信号在EPCs生物活性调控和增殖、分化成熟中起到关键作用。 鉴于川崎病病因及发病机制仍不明确,而川崎病患几EPCs状态的临床研究有限,且受到细胞间相互作用、药物干预及伦理学等多方面问题的制约,我们无法深入研究EPCs的真实状态。因此,本研究通过干酪乳杆菌细胞壁萃取物(LCWE)免疫刺激构建小鼠川崎病冠状动脉病变模型,检测小鼠骨髓EPCs含量及otch4的表达,同时进行体外培养,研究川崎病冠状动脉损伤时,EPCs的含量、Notch4的表达及EPCs功能的改变,以及在mRNA和蛋白水平上Notch4及其下游信号RBP-Jκ的表达变化。 目的： 通过LCWE诱导川崎病冠脉损伤的小鼠模型,在其不同病程阶段探究骨髓EPCs含量、Notch4的表达和EPCs功能的改变及Notch4-RBP-Jκ信号通路在川崎病冠脉损伤及修复中的作用。 方法： 第一部分：小鼠骨髓EPCs的培养及功能检测与鉴定 1.用干酪乳杆菌制备干酪乳杆菌细胞壁萃取物(LCWE)。 2. BALB/C品系雄性小鼠,通过单次腹腔注射LCWE,建立小鼠川崎病冠状动脉损伤模型。 3.用密度梯度离心法获取小鼠骨髓单个核细胞,用EGM-2培养7天后进行相关检测。 4.细胞增殖活力检测：用CCK试剂盒检测细胞增殖活力,用酶标仪测定在450nm处的吸光度,并计算其活力。 5.细胞粘附能力检测：用胰酶消化细胞,并重新接种于24孔板内,置于培养箱内培养30min后,PBS冲洗后显微镜下计数贴壁细胞。 6.细胞迁移能力检测：用插入式Transwell24孔板检测细胞迁移能力,在显微镜下进行细胞计数。 7.体外血管形成能力：将EPCs接种于ECMatrix胶上,置于培养箱内培养,并于4、6、8、10、12h在显微镜下观察小(血)管生成情况。 8.免疫荧光 (1)免疫双荧光鉴定：用DiI-acLDL和FITC-UEA-I孵育细胞,用DAPI染核,于激光共聚焦显微镜下观察。 (2) RBP-Jκ和VEGFR-2免疫荧光检测：分别用RBP-Jκ和VEGFR-2抗体孵育细胞,用DAPI染核,于激光共聚焦显微镜下观察。 第二部分：检测川崎病不同病程阶段小鼠骨髓EPCs含量和Notch4的表达 1.分别取LCWE腹腔注射后3d,7d,14d,28d的小鼠及对等时间的对照组小鼠,分离出骨髓单个核细胞,用CD34-eFluro660, Notch4-PE, Flk-1-FITC, CD45-Percp-cy5.5标记细胞,用流式细胞术检测EPCs和Notch4(+)EPC的含量。 2.体外培养小鼠骨髓EPCs7天后,用胰酶消化细胞,制备细胞悬液,同样用流式细胞术检测EPCs和Notch4(+) EPC的含量。 第三部分：荧光定量PCR检测NOTCH4. RBP-Jκ信号通路、及内皮相关因子P-Selectin. VCAM-1的mRNA的表达 定量PCR检测体外培养的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、 VCAM-1在mRNA水平的表达。 第四部分：Western Blot检测体外培养的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ、 VEGFR-2蛋白的表达 提取体外培养的小鼠骨髓EPCs的总蛋白,经过SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,孵育一抗、二抗,加化学发光底物显色,显影等步骤,获得蛋白表达的影像,扫描并分析蛋白条带灰度值。 结果： 第一部分：体外培养的小鼠骨髓EPCs的功能检测与鉴定 1.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs集落形成能力显著降低。 2.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的增殖活力明显低于对照组。 3.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的粘附能力明显低于对照组。 4.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的迁移能力明显低于对照组。 5.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的体外血管形成能力能力明显低于对照组。 6.免疫荧光 (1)免疫双荧光鉴定：各LCWE处理组双阳性率明显低于对照组。 (2) RBP-J κ阳性表达率：LCWE处理组在3d组、7d组、14d组明显低于对照组。 (3) VEGFR-2阳性表达率：LCWE处理组在3d组、7d组、14d组明显低于对照组。 第二部分：小鼠骨髓EPCs的含量和Notch4的表达 1.取骨髓单个核细胞直接流式检测结果：各LCWE处理组的EPCs含量明显低于对照组。而LCWE处理组在3d组、7d组、14组Notch4(+) EPCs含量却明显高于对照组,28d组Notch4(+) EPCs含量虽然也高于对照组,但差异无显著统计学意义。 2.体外培养的川崎病小鼠模型骨髓EPCs含量明显低于对照组。而Notch4(+) EPCs含量却明显高于对照组。 第三部分：体外培养的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、 VCAM-1的mRNA水平 1. NOTCH4mRNA:3d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。 2. RBP-Jκ mRNA:3d、7d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。 3. P-Selectin mRNA:3d组LCWE处理组的mRNA表达水平明显低于对照组。 4. VCAM-1mRNA:各LCWE处理组与对照组差异均无显著统计学意义。 第四部分：体外培养的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ和VRGFR-2蛋白的表达 1. RBP-Jκ蛋白：3d组LCWE处理组RBP-Jκ蛋白表达明显低于对照组。 2. VRGFR-2蛋白：各LCWE处理组与对照组差异均无显著统计学意义。 结论： 1.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs数量明显减少。 2.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs的各项功能和生物活性严重受损。 3. Notch4-RBP-Jκ信号通路参与了川崎病冠脉损伤及修复,其具体机制需要进一步研究。
【关键词】：川崎病 骨髓内皮祖细胞 Notch4 RBP-Jκ VEGFR-2 LCWE
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.4
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-10
• Abstract10-16
• 英文缩写词与中英文索引16-17
• 目次17-18
• 1 引言18-22
• 2 材料与方法22-35
• 3 结果35-46
• 4 讨论46-50
• 5 结论50-51
• 参考文献51-56
• 综述56-89
• 参考文献71-89
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果89

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 徐明国;门丽娜;王海霞;祖莹;赵春玉;赵霞;蔡华波;孟祥春;王涛;;川崎病患儿循环内皮祖细胞功能与血浆超敏C反应蛋白浓度的关系[J];中国当代儿科杂志;2010年07期

2 徐明国;门丽娜;祖莹;赵春玉;孟祥春;;人血丙种球蛋白和阿司匹林治疗对川崎病患儿循环内皮祖细胞功能的影响[J];中国当代儿科杂志;2011年12期

3 Stefano Capobianco;Venu Chennamaneni;Mayank Mittal;;Endothelial progenitor cells as factors in neovascularization and endothelial repair[J];World Journal of Cardiology;2010年12期

  本文关键词：内皮祖细胞Notch4信号通路在川崎病模型冠脉损伤及修复中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：375923