AMPK激活促自噬反应参与心肌慢性缺氧适应的作用及机制研究

发布时间：2017-06-13 12:17

  本文关键词：AMPK激活促自噬反应参与心肌慢性缺氧适应的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及目的:先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是婴幼儿常见的疾病之一,目前CHD整体的手术治愈率较以前已明显改善,但紫绀型先天性心脏病(cyanotic congenital heart disease,CCHD)的手术死亡率仍然较高。慢性缺氧(chronic hypoxia)是大部分CCHD病的共有的病理生理过程。目前CCHD的心肌慢性缺氧适应的分子机制尚不清楚。因此,深入研究心肌细胞慢性缺氧适应的分子机制可为改善CCHD的临床治疗提供新的心肌保护策略。AMPK是广泛存在于真核细胞的Ser/Thr蛋白激酶,已有研究证实,在慢性缺氧条件下,活化的AMPK参与心肌细胞能量代谢。新近研究表明,在肿瘤细胞中,活化的AMPK和自噬反应密切相关。我们推测:在心肌细胞慢性缺氧适应中,AMPK可能通过调节自噬对心肌细胞产生保护作用。本研究拟从下面三个方面进行验证:1.检测活化AMPK在慢性缺氧心肌组织中的表达水平;2.研究AMPK活化水平对心肌细胞慢性缺氧适应的影响;3.探讨AMPK活化水平对慢性缺氧心肌细胞自噬水平的影响。研究方法:1.选用清洁级4-6周龄雄性SD大鼠24只,随机将其平均分为常氧组和缺氧组。将缺氧组置入低压舱(模拟海拔5000m,气压405mm Hg),常氧组正常饲养。同时喂养28d后,处死大鼠后迅速取出心脏并分离出右心室部分作为标本;入选第三军医大学第二附属医院心血管外科2013年全年行手术矫治的先心病患儿24例,平均将其分为紫绀组和非紫绀组,于术中收集切除的右室流出道心肌组织作为标本。采用Western blot分别检测p-AMPK在大鼠、人体缺氧和正常心肌组织中的表达水平。2.选用H9c2心肌细胞株,并将其分为常氧组、低氧组、阻断组、激活组。将低氧组、阻断组、激活组三组细胞置入缺氧培养箱3d(94%N2,5%CO2,1%O2),建立H9c2心肌细胞株慢性缺氧模型;常氧组置入细胞培养箱3d(74%N2,5%CO2,21%O2),对照培养。分别向阻断组和激活组中加入AMPK特异性阻断剂Compound C和激活剂AICAR,采用Western blot验证活化AMPK的表达,流式细胞仪、TUNEL法检测并评价心肌细胞凋亡情况,Hoechst染色观察因细胞坏死引起的细胞核形态变化、LDH测定心肌细胞乳酸释放率评价心肌细胞坏死程度。3.采用westernblot分别检测常氧组、缺氧组、阻断组和激活组lc3的表达水平。结果:1.ampk在正常和慢性缺氧组织中的激活水平westernblot结果显示与正常心肌组织相比,缺氧心肌组织中p-ampk/ampk比值明显增高:在人体心肌组织方面,紫绀组心肌组织ampk蛋白磷酸化水平和非紫绀组相比,明显增加,p0.005;在大鼠心肌组织方面,慢性缺氧组sd大鼠心肌组织中ampk蛋白激活水平和常氧组相比,明显增加,p0.005。2.ampk激活对慢性缺氧心肌细胞的保护作用(1)心肌细胞ampk激活水平验证实验中,westernblot结果显示与低氧组相比,阻断组ampk激活水平降低,p0.01;激活组ampk激活水平升高,p0.01。(2)与低氧组相比,阻断组心肌细胞凋亡水平升高,与此同时,激活组心肌细胞凋亡水平降低。细胞流式术:与低氧对照组相比,ampk阻断组凋亡细胞比例明显增多,与此同时,ampk激活组凋亡细胞比例明显减少。tunel实验:与低氧对照组相比,ampk阻断组tunel-阳性细胞比例增多(p0.05),与此同时,ampk激活组tunel-阳性细胞减少(p0.05)。(3)与低氧组相比,阻断组心肌细胞坏死程度增高,与此同时,激活组心肌细胞坏死程度降低。hoechst染色:与低氧对照组相比,ampk阻断组不正常核细胞比例明显增多(p0.01),与此同时,ampk激活组不正常核细胞比例减少(p0.05)。ldh实验:与低氧对照组相比,ampk阻断组细胞乳酸释放率明显升高(p0.01),与此同时,ampk激活组细胞乳酸释放率明显降低(p0.05)。3.ampk激活对慢性缺氧心肌细胞自噬反应的影响westernblot结果显示与心肌细胞低氧组相比,ampk阻断组自噬水平(lc3Ⅱ/lc3Ⅰ)明显降低,p0.01;ampk激活组自噬水平(lc3Ⅱ/lc3Ⅰ)明显升高,p0.01。结论:1.紫绀型先心病和慢性缺氧sd大鼠的心肌组织中p-ampk/ampk比值与非紫绀型先心病和常氧sd大鼠的心肌组织相比明显增高。提示慢性缺氧心肌组织中ampk激活水平明显增加。2.慢性缺氧条件下培养h9c2细胞72h,加入compoundc阻断ampk激活,h9c2细胞凋亡和坏死水平增高;加入AICAR促进AMPK激活,H9c2细胞凋亡和坏死水平降低。提示在心肌慢性缺氧适应中,AMPK激活对H9c2细胞具有一定的保护作用。3.慢性缺氧条件下培养H9c2细胞72h,加入Compound C阻断AMPK激活,H9c2细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低;加入AICAR促进AMPK激活,H9c2细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增高。提示AMPK激活促进H9c2细胞自噬反应可能是心肌细胞适应慢性缺氧的机制之一。
【关键词】：AMPK 心肌慢性缺氧 自噬
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R726.5
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-17
• 1.1 选题缘由12
• 1.2 研究背景12-15
• 1.3 研究方法15-17
• 第二章 AMPK在慢性缺氧心肌组织中的激活水平17-26
• 2.1 材料与方法17-23
• 2.2 实验结果23-24
• 2.3 讨论24-26
• 第三章 AMPK激活对慢性缺氧心肌细胞的保护作用26-35
• 3.1 材料与方法26-30
• 3.2 实验结果30-33
• 3.3 讨论33-35
• 第四章 探讨AMPK激活对慢性缺氧心肌细胞自噬水平的影响35-38
• 4.1 材料与方法35
• 4.2 实验结果35-36
• 4.3 讨论36-38
• 全文结论38-39
• 参考文献39-43
• 文献综述 心肌代谢的慢性缺氧适应43-56
• 参考文献49-56
• 攻读学位期间发表的论文56-57
• 致谢57

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  本文关键词：AMPK激活促自噬反应参与心肌慢性缺氧适应的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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