miR-375过表达对心肌样细胞增殖、凋亡和分化的影响

发布时间：2017-07-07 13:10

  本文关键词：miR-375过表达对心肌样细胞增殖、凋亡和分化的影响

  更多相关文章： miR-375 P19细胞 增殖 凋亡 分化 Notch信号通路

【摘要】：心脏是胚胎发育过程中最早形成的器官,其间涉及许多相关基因依时空顺序差次表达以及多条信号通路(如Notch信号通路、BMP信号通路、Wnt信号通路等)的精确调控,以保证心肌细胞的正确迁移、增殖以及分化。其中,任意基因的异常都有可能导致先天性心脏病的发生。先天性心脏病是新生儿期最常见的先天畸形之一,发病率高达0.8%~1%,是导致人类孕期流产、死胎和新生儿发育缺陷甚至死亡的主要原因之一,严重危害着人类的健康和生存质量,给家庭和社会带来巨大的负担。因此,从基因和分子水平探索胚胎心脏形成及发育机制成为防治先天性心脏病基础研究新方向之一。MicroRNA(mi RNA)是一类长约22 nt的非编码小RNA,通过与靶基因mRNA的3’UTR区域结合,介导mRNA降解或抑制其转录后水平的表达,导致靶标蛋白表达降低,从而参与并调控时序发育、细胞凋亡、细胞分化、激素分泌等生理过程及多种疾病发生过程,其表达水平的变化与疾病的发生密切相关。研究发现miRNAs无论是在细胞增殖、分化,还是在生物发育及疾病发生发展过程中均发挥重要作用,因而引起了研究人员越来越多的关注。有关研究表明,miRNA不仅参与了心脏发育与心肌重构,并且在心脏疾病的发生发展中起着一定作用。本研究小组前期通过生物芯片技术筛选发现,miR-375基因在室间隔缺损胚胎心肌组织中的表达丰度显著高于正常人工流产胚胎心肌组织,随后我们采用实时荧光定量PCR验证了这一结果;另外我们还发现miR-375在先天性心脏病胎儿的孕母(妊娠18-22周)血液中也呈现高表达,提示miR-375很有可能在胚胎心脏发育过程中发挥着重要作用。但miR-375致胚胎心脏发育畸形的功能与机制研究目前并无文献报道。鉴于P19细胞和斑马鱼是心脏发育分子机制研究的经典模型,本研究借助上述模型,通过改变miR-375表达水平,探讨了miR-375过表达对P19细胞增殖、凋亡、分化的影响,评价了其在斑马鱼胚胎心脏发育中的功能,并初步分析了miR-375下游作用的靶标,为先天性心脏病发病机制的基础研究提供新线索。第一部分mir-375过表达对p19细胞增殖、凋亡的影响目的:构建mir-375过表达质粒,筛选出稳定过表达mir-375的p19细胞株,研究mir-375对p19细胞增殖、凋亡的影响;获得mir-375过表达影响斑马鱼胚胎心脏发育的表型。方法:构建mir-375过表达质粒,与gfp(greenfluorescentprotein,绿色荧光蛋白)对照载体分别转染p19细胞,嘌呤霉素筛选两周,荧光观察和qrt-pcr验证筛选出稳定表达mir-375的细胞株。cck-8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期;并用hoechst染色、流式细胞计数分析、实时荧光定量pcr等技术,检测bax/bcl-2表达水平;westemblot法检测凋亡过程中蛋白水平的变化,以评价mir-375对p19细胞凋亡的影响;斑马鱼单细胞期显微注射mir-375minics观察mir-375对胚胎心脏形态学的影响。结果:mir-375过表达抑制了p19细胞的增殖;抑制p19细胞进入s期,凋亡相关的bax/bcl-2比值增高,细胞凋亡增加;mir-375过表达可致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形表型。结论:mir-375过表达能够影响p19细胞的增殖与凋亡功能,并致斑马鱼胚胎发育出现心包水肿等心脏畸形表型。第二部分miR-375过表达对P19细胞分化和Notch信号通路的影响目的:研究mi R-375过表达对P19细胞分化、Notch信号通路的影响。方法:诱导稳定过表达miR-375的P19细胞向心肌细胞分化,实时荧光定量PCR检测心肌细胞分化过程中心肌特异性标记物GATA4、cTnT、Mef2c的变化以及Notch信号通路相关因子在分化过程中的表达变化,Westem blot法检测分化过程中相关蛋白表达的变化。荧光素酶验证Notch2是否是miR-375的下游靶标。结果:miR-375过表达可抑制P19细胞向心肌细胞的分化,心肌标记物的表达量在细胞分化过程中逐渐升高,但就某一分化点而言,心肌标记物表达量在miR-375过表达组中较对照组低;Notch2是miR-375的下游靶标,miR-375过表达可能通过抑制Notch信号通路进而影响P19细胞的分化。结论:mi R-375过表达可能通过影响Notch信号通路,影响P19细胞向心肌细胞的分化。
【关键词】：miR-375 P19细胞 增殖 凋亡 分化 Notch信号通路
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.4
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-14
• 第一部分 miR-375过表达对P19细胞增殖、凋亡的影响14-40
• 材料与方法14-29
• 结果29-37
• 讨论37-40
• 第二部分 miR-375过表达对P19细胞分化和Notch信号通路的影响40-54
• 材料与方法40-47
• 结果47-52
• 讨论52-54
• 结论54-55
• 参考文献55-61
• 综述61-74
• 参考文献67-74
• 缩略语74-75
• 攻读硕士期间发表文章情况75-76
• 附录76-79
• 致谢79-80

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张玉勤;;细胞分化再活化治疗肿瘤[J];国外医学情报;1991年01期

2 David　Tenenbaum,饶新华;细胞之源[J];世界科学;2000年11期

3 闫贵新;干细胞研究的重大进展[J];畜牧兽医科技信息;2000年11期

4 赵志力;付小兵;;正常与异常的细胞分化[J];感染.炎症.修复;2001年03期

5 赵志力;付小兵;;修复细胞分化的调控机制与鉴别[J];感染.炎症.修复;2001年04期

6 赵志力;修复细胞分化的调控机制与鉴别[J];中国危重病急救医学;2002年02期

7 赵志力;付小兵;;不同发育阶段细胞的分化与调控机制[J];感染.炎症.修复;2002年01期

8 戴新贵;姚咏明;艾宇航;;辅助性T细胞17的研究进展[J];生理科学进展;2008年04期

9 ;细胞分化:一个两阶段的过程[J];中华妇幼临床医学杂志;2009年02期

10 黄绍勤;曹惠珍;;生命的基本单位——细胞[J];广医通讯;1980年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 徐志彦;;《细胞分化》教学案例(教学内容安排1课时)[A];河北省教师教育学会第二届中小学教师教学案例展论文集[C];2013年

2 尹青;张雷;李莉;谢丹丹;龚淼;;体外心肌样环境对P19细胞向心肌细胞分化的诱导作用[A];中国解剖学会2012年年会论文文摘汇编[C];2012年

3 丁建东;;图案化表面与干细胞分化[A];2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——大会邀请报告[C];2013年

4 陈思;黄欣;陈少华;杨力建;郑海涛;李扬秋;;BCL11B基因在T细胞分化和增殖中调节作用的研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年

5 江键;崔黎丽;宋诚荣;王小平;宋茂海;;负极性驻极体诱导3T3细胞表面电荷和游离钙浓度的变化[A];第四届中国功能材料及其应用学术会议论文集[C];2001年

6 梁冀;于会梅;傅继东;郭昂;杨黄恬;;内质网钙离子释放受体对干细胞分化的调控[A];中国病理生理学会受体、肿瘤和免疫专业委员会联合学术会议论文汇编[C];2010年

7 罗家江;;TH17细胞的研究进展[A];全国中西医结合血液学学术会议论文汇编[C];2010年

8 项盈;金洁;沈丹;郑强;谢纯刚;贾冰冰;黄国平;王金福;;复苏的人骨髓间充质干细胞的分离、培养及向多系细胞分化的诱导[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

9 汪洋;朱椰凡;余华军;符竣惠;徐启纲;曾其强;吴建波;张启瑜;;三种全肝脏去细胞化流程对细胞外基质的影响及细胞组分残留量的研究[A];2013年浙江省外科学学术年会论文汇编[C];2013年

10 常平安;陈瑞;李薇;伍一军;;神经病靶标酯酶的增强表达抑制哺乳动物细胞的增殖[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 徐荣祥;人类生命细胞 再生物质的发现与研究[N];健康报;2007年

2 张佳星;干细胞分化路径存在差异性[N];中国矿业报;2008年

3 史军;剥开黏合的细胞之书[N];健康报;2012年

4 常丽君;美生物学家打造出“细胞黑客”[N];科技日报;2010年

5 张佳星;分化之路 殊途同归[N];科技日报;2008年

6 记者 施嘉奇　通讯员 王姿英;探索中药对干细胞分化的作用[N];文汇报;2009年

7 记者陈超;日开发细胞间隔离培养技术[N];科技日报;2003年

8 陈超;科学家发现引发细胞分化的分子通道[N];科技日报;2010年

9 记者 白毅;我国科学家用iPS细胞首获克隆猪[N];中国医药报;2013年

10 记者 钱铮;日本用人类iPS细胞首次制成血小板[N];新华每日电讯;2009年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 唐绍灿;IL-27、Th1及Th17细胞在MS中的表达及其作用机制研究[D];山东大学;2015年

2 常凯凯;子宫内膜异位灶微环境IL-10~+Th17细胞的形成及作用机制[D];复旦大学;2014年

3 高华嵩;细胞重编程技术和移植治疗视神经损伤的实验研究[D];复旦大学;2014年

4 李艳明;Hsa-miR-200a调控红细胞分化的功能及分子机制研究[D];中国科学院北京基因组研究所;2015年

5 张林;C-反应蛋白通过对T细胞分化的直接调控参与后天免疫应答[D];兰州大学;2015年

6 蒋云秋;树突状细胞Notch信号在1，，25-二羟维生素D3调节Th17分化中的作用研究[D];第三军医大学;2015年

7 史莉瑾;急性脑出血患者外周血调节性T细胞与脑相关抗原的特征及其相关性研究[D];郑州大学;2015年

8 陈博;可注射细胞微球明胶复合物联合血小板裂解液在牙组织工程中的应用研究[D];第四军医大学;2015年

9 章丽雅;血红素加氧酶-1调抑Th17细胞在炎症性肠病中的作用及机制研究[D];上海交通大学;2013年

10 王玲玲;重组家蚕素Ⅱ对哺乳细胞胰岛素样作用及其机制的体外研究[D];吉林大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 丁佳敏;芪蓝制剂对人舌鳞癌Tca8113细胞的抗增殖和促凋亡作用的机制研究[D];福建医科大学;2015年

2 张卓亚;间充质干细胞对B6.MRL-Fas~(lpr)小鼠滤泡辅助T细胞的调节作用及机制研究[D];南京大学;2015年

3 周明;As_2O_3联合γ分泌酶抑制剂影响肝癌HepG_2细胞耐药性的研究[D];石河子大学;2015年

4 刘冰慧;凋亡细胞对巨噬细胞IL-12家族细胞因子调控的研究[D];河北医科大学;2015年

5 韩青青;Th22细胞及其效应因子IL-22与类风湿关节炎及合并间质性肺病相关性的研究[D];河北医科大学;2015年

6 张腾飞;吉西他滨与AMD3100联合应用于胆管癌RBE细胞株对CXCR4/CXCL12轴的作用[D];河北医科大学;2015年

7 王們X ;EAAL细胞联合全反式维甲酸对人肺腺癌细胞株A549体内外作用的研究[D];河北医科大学;2015年

8 李超楠;两种典型OPFRs对PC12细胞的神经毒性及其机制探究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2015年

9 杨明;促肾上腺皮质激素释放因子1型受体经cAMP/PKA信号通路对U87MG细胞凋亡机制的研究[D];河北医科大学;2015年

10 李广康;RNAi沉默Rap2B基因对恶性转化BEAS-2B细胞的作用[D];郑州大学;2015年

本文编号：530317