肺炎支原体外毒素CARDS TX的制备及特性研究

发布时间：2017-07-17 13:26

  本文关键词：肺炎支原体外毒素CARDS TX的制备及特性研究

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【摘要】：背景和目的： 最新研究发现肺炎支原体(Mycoplasma penumoniae, MP)毒力因子--社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(Community-acquired respiratory distress syndrome toxin, CARDS TX)参与MP侵犯呼吸道等病理生理过程。CARDS TX是由MP基因MPN372编码表达的68KDa蛋白质,主要分布于MP胞膜表面和胞质,具有二磷酸腺苷核糖转移酶(ADP-ribosyltransferase, ART)活性,能造成宿主细胞空泡化,最终导致细胞死亡,参与了MP肺炎等疾病过程。因而被认为是MP的一个重要毒力因子,对其的深入研究可能为MP感染的发病机制提供了一个新的研究方向。 本研究拟在体外重组表达并纯化具有活性的CARDS TX,并制备其兔多克隆抗体。为了更好的阐明CARDS TX的特性以及其在MP感染发病机制中的作用,我们进一步研究了CARDS TX在人肺腺癌A549细胞中的定位,对DNA损伤的影响及对人视网膜色素上皮RPE细胞纤毛长度的影响。 方法： 1.构建带有His-tag的表达载体Pet28b (+)-CARDS,经Ni柱纯化得到单一重组的CARDS TX (rCARDS TX). 2.倒置显微镜观察细胞形态学及MTT检测细胞存活率。 3.免疫荧光法检测MP或rCARDS TX处理A549细胞后CARDS TX在细胞的分布,及其与MP粘附的关系。 4.免疫荧光法检测γH2AX。 5.免疫荧光法检测人视网膜色素上皮RPE细胞纤毛的长度。结果： 1.采用BamHI和Xhol限制性内切酶双酶切鉴定质粒PET-28b(+)-CARDS,凝胶电泳可见CARDS TX基因片段大小为1773bp。通过考马斯亮蓝染色,纯化的rCARDS TX蛋白清晰可见。 2. rCARDS TX处理的细胞生长明显受到抑制,且部分细胞出现了空泡化,50μg/ml处理组细胞空泡化严重并导致细胞死亡,细胞数目减少。MTT试验显示rCARDS TX处理的A549细胞存活率明显下降。 3.免疫荧光显示CARDS TX在A549细胞的细胞质和细胞核均有分布,胰酶处理MP后,CARDS TX在细胞内的分布减少。 4. rCARDS TX处理A549细胞后细胞核内形成γH2AX焦点。 5.MP或rCARDS TX处理RPE细胞后,纤毛长度明显下降。结论： 1.成功的构建Pet28(+)-CARDS表达载体,并纯化出具有活性的rCARDS TX. 2.在MP或rCARDS TX处理的A549细胞中,CARDS TX在细胞的细胞质和细胞核均有分布,并且与MP的黏附力有关,当MP黏附力下降时,CARDS TX在细胞内的分布减少。 3.rCARDS TX和MP均可引起细胞DNA的损伤。 4.MP和rCARDS TX均可导致RPE细胞纤毛长度变短。
【关键词】：肺炎支原体 毒素 粘附 DNA损伤 纤毛
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R725.6
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 中英文缩略词10-12
• 目次12-13
• 1 引言13-17
• 2 材料与方法17-35
• 2.1 主要材料和试剂17-23
• 2.2 主要实验方法23-35
• 3. 实验结果35-45
• 3.1 重组质粒PET-28b(+)-CARDS的酶切鉴定35-36
• 3.2 CARDS TX在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达及纯化36-37
• 3.3 CARDS TX生物活性的验证37-39
• 3.4 CARDS TX在A549细胞内的分布及与MP粘附的关系39-41
• 3.5 rCARDS TX诱导γH2AX焦点形成41-43
• 3.6 MP和rCARDS TX致RPE细胞纤毛长度变短43-45
• 4. 讨论45-49
• 5. 结论49-50
• 6. 不足和进一步工作展望50-51
• 参考文献51-57
• 综述57-67
• 参考文献64-67
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果67-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 阳爱梅;宋建辉;黄榕;金世杰;杨萍;;1026例儿童肺炎支原体感染及耐药情况分析[J];中国当代儿科杂志;2013年07期

2 余艳柯,陆源,余应年,杨军;γH2AX:DNA双链断裂的标志[J];中国药理学与毒理学杂志;2005年03期

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本文编号：553820