一种基于悬液芯片的呼吸道病毒多重检测方法

发布时间：2017-08-07 14:24

  本文关键词：一种基于悬液芯片的呼吸道病毒多重检测方法

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【摘要】：呼吸道病毒是常见的引发急性呼吸道疾病的病原体,当大规模流行性疾病暴发或急性呼吸道疾病需要尽快进行临床诊断时,快速鉴定病原体对疾病控制和治疗是至关重要的。本文旨在建立一种基于悬液芯片技术的多种呼吸道病毒并行快速检测方法,以BioPlex-200悬液芯片技术检测平台为基础,依据NCBI公开数据库中呼吸道病毒的基因组序列,设计各种针对呼吸道病毒的特异性引物组和核酸探针,用多重不对称PCR方法结合悬液芯片检测的方式,可在5-6个小时的时间内实现10种呼吸道病毒或亚型的快速检测,从而达到节省时间、节约成本和降低劳动量的目的。 依据NCBI公开数据库上各病毒的基因序列信息,选定病毒基因组中的保守区域为检测靶点,针对10种呼吸道病毒或亚型,包括腺病毒(AdV),偏肺病毒(hMPV),流感病毒A型(IfA),流感病毒B型(IfB),呼吸道合胞病毒(RSV),副流感病毒1型(PIV1),副流感病毒2型(PIV2),副流感病毒3型(PIV3), SARS病毒(SARS),人类疱疹病毒1型(HSV1),设计并合成相应引物组和探针序列,病毒核酸直接经PCR或反转录后经PCR对目的序列进行扩增,产物与核酸探针微球组杂交,于BioPlex-200悬液芯片系统检测荧光信号值。经过检测方法的优化,各病毒的检测灵敏度分别能达到：IfA约30DNA拷贝；AdV、IfB、PIV2、 PIV3、RSV、HSV1与SARS约3DNA拷贝；hMPV和PIV1约1DNA拷贝。对29个经传统方法鉴定为呼吸道病毒的临床样本,在悬液芯片检测中,共检测出阳性样本27个,检出率93.1%。部分临床样本经测序分析,检测结果与悬液芯片结果一致。
【关键词】：呼吸道病毒 悬液芯片 多重PCR 不对称PCR
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R725.6
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 引言7-10
• 第一章 材料与方法10-24
• 第一节 材料10-11
• 1. 样本来源10
• 1.1 病毒标准细胞株10
• 1.2 临床标本10
• 1.3 阳性对照样本10
• 2. 主要试剂10-11
• 3. 仪器设备11
• 第二节 方法11-24
• 1. 病毒标准克隆与阳性对照克隆的构建11-19
• 1.1 目的序列的选择12-14
• 1.2 样本来源14
• 1.3 核酸的抽提14
• 1.4 病毒RNA反转录合成cDNA链14-15
• 1.5 PCR扩增15
• 1.6 构建病毒特异性序列克隆15-18
• 1.7 测序验证18-19
• 2. 核酸探针微球制备19-22
• 2.1 核酸探针的设计与合成19-20
• 2.2 羧基微球的选择20
• 2.3 核酸探针与羧基微球偶联20-21
• 2.4 杂交验证21-22
• 3. 样本核酸抽提22
• 4. 多重呼吸道病毒悬液芯片检测方法22-24
• 4.1 多重反转录反应22
• 4.2 多重PCR扩增22-23
• 4.3 杂交23
• 4.4 信号标记23
• 4.5 检测23
• 4.6 测序验证23-24
• 第二章 结果24-32
• 第一节 构建克隆的测序结果24-26
• 第二节 核酸探针微球偶联效果验证结果26-27
• 第三节 呼吸道病毒悬液芯片检测体系的构建及样本检测结果27-32
• 1. PCR条件优化27-28
• 2. 杂交条件优化28
• 3. 特异性和灵敏度检测28-30
• 3.1 特异性检测28-29
• 3.2 灵敏度检测29-30
• 4. 临床样本检测30-32
• 第三章 讨论32-36
• 第一节 构建克隆结果讨论32
• 1. 克隆测序及序列比对32
• 2. 构建克隆的应用32
• 第二节 核酸探针微球制备的讨论32-33
• 第三节 呼吸道病毒悬液芯片检测体系的构建及样本检测结果的讨论33-36
• 结论36-37
• 参考文献37-39
• 综述39-55
• 参考文献52-55
• 致谢55-56

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1 隋z裚";王大燕;舒跃龙;;呼吸道病毒多病原检测技术研究进展[J];病毒学报;2013年02期

2 章爱莲;吴鸣;张旭;吴晓燕;;住院儿童常见呼吸道病毒检测结果[J];浙江预防医学;2013年04期

3 庞作章;;美国1983～1984年呼吸道病毒监测[J];国外医学(微生物学分册);1984年02期

4 张励力,邓小艺,王剑,韩洪彦;某部新兵冬训中呼吸道病毒感染情况调查研究[J];解放军预防医学杂志;1998年05期

5 ;2014年“呼吸道病毒中药治疗新进展”病例征集大赛——邀您共同开启创新中药呼吸道病毒治疗循证之旅[J];中国全科医学;2014年11期

6 子墨;;呼吸道病毒知多少[J];中华养生保健;2011年12期

7 邵芳;王亚娟;林影;谢正德;申昆玲;;多重聚合酶链反应和反向线性点杂交技术在常见呼吸道病毒检测中的应用[J];山东医药;2010年52期

8 赵百慧;沈佳仁;高烨;俞雪莲;张曦;吴凡;;2009-2010年上海市儿童呼吸道病毒病原谱的建立和分析[J];卫生研究;2011年05期

9 ;36种中草药对呼吸道病毒所致细胞病变抑制作用的初步观察[J];江苏医药;1976年02期

10 容中生;;呼吸道病毒感染性疾病[J];国外医学(内科学分册);1984年09期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 司萍;李胜英;王维;张桦;;2007-2011年儿童常见呼吸道病毒的流行趋势[A];中华医学会第七次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2012年

2 李磊;;呼吸道病毒检测20项在我实验室应用现状[A];全国临床免疫检验研讨会暨第六届全国临床免疫学术会议论文汇编[C];2009年

3 李际强;王怀振;买买提艾力·吐尔逊;李黎;刘妮;张奉学;罗翌;;四种维药对常见呼吸道病毒作用的体外实验研究[A];2012中国中西医结合学会急救医学专业委员会学术年会论文集[C];2012年

4 张万菊;何静;管文采;田棣;刘yN;钱方兴;俞慧菊;李扬;周志统;胡芸文;;多重PCR检测方法和液态芯片技术在呼吸道病毒检测中的应用研究[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2011年

5 孟宇航;刘海燕;邓书;;中草药在防治畜禽呼吸道病毒病上的应用前景[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（下册）[C];2009年

6 伍严安;曾秀雅;苏跃清;吴小青;付希;;应用多重RT-PCR检测4种新型呼吸道病毒[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

7 郑吉善;苏苗赏;李昌崇;金小红;陈小芳;;5岁以下儿童哮喘急性发作时呼吸道病毒病原学检测分析[A];2005年浙江省儿科学学术年会论文汇编[C];2005年

8 董竞成;刘羽华;宫兆华;董晓辉;谢瑾玉;巫善美;;扶正祛邪颗粒对呼吸道病毒易感人群免疫细胞及因子的影响[A];第七次全国中西医结合呼吸病学术交流大会论文汇编（一）[C];2004年

9 杨文杰;袁红娟;林燕萍;;非病毒性呼吸道感染与哮喘[A];第六次全国中西医结合变态反应学术大会论文汇编[C];2013年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 张见麟;新发现的呼吸道病毒[N];健康报;2007年

2 杨进;中医治疗呼吸道病毒性感染的思考[N];中国医药报;2006年

3 马世骏;瑞典发现新型儿童呼吸道病毒[N];医药经济报;2005年

4 记者 李天舒;我国发现一种新的呼吸道病毒[N];健康报;2008年

5 ;防病美味汤[N];上海中医药报;2008年

6 记者 段佳;我国学者找到呼吸道病毒新克星[N];大众科技报;2009年

7 魏开敏;冬春季为何容易反复感冒[N];家庭医生报;2006年

8 本报记者 罗冰 通讯员 胡永峰;记大连化学物理研究所研究员许国旺[N];科技日报;2003年

9 本报特约撰稿人 陈本川;抗流感药物研发还须“硬拼”[N];医药经济报;2003年

10 黄建华;科学饮食赶走春困[N];大众卫生报;2007年

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1 李晓燕;呼吸道病毒高通量悬浮芯片检测方法的建立及新现呼吸道病毒的分子特征分析[D];天津医科大学;2011年

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1 陈沁;一种基于悬液芯片的呼吸道病毒多重检测方法[D];复旦大学;2013年

2 赵海龙;重要呼吸道病毒快速检测方法的建立[D];中国人民解放军军事医学科学院;2006年

3 杨丹丽;新型核酸检测系统用于高通量诊断多种呼吸道病毒的研究[D];北京协和医学院;2013年

4 向蕾;多重实时荧光RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究[D];中山大学;2014年

5 王凯;常见呼吸道病毒高灵敏度快速检测方法的研究[D];陕西师范大学;2013年

6 胡春燕;呼吸道病毒与慢性鼻—鼻窦炎的相关性研究[D];华中科技大学;2012年

7 帅维正;呼吸道病毒多重逆转录聚合酶链反应检测方法的建立及应用[D];第三军医大学;2010年

8 王洁;四种常见呼吸道病毒靶序列富集多重PCR-液相芯片检测方法的建立及初步应用[D];南京师范大学;2014年

9 孙婷婷;呼吸道病毒高通量PCR-MassARRAY检测方法的建立[D];延边大学;2011年

10 陆柔剑;四种常见及新发呼吸道病毒荧光PCR检测方法的建立与初步应用[D];中国疾病预防控制中心;2007年

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本文编号：635134