柯萨奇病毒A组16型感染性cDNA构建及应用

发布时间：2017-08-21 17:12

  本文关键词：柯萨奇病毒A组16型感染性cDNA构建及应用

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【摘要】：手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒感染引起的儿童急性传染性疾病,柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)为其主要的病原体之一。CVA16属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)人肠道病毒A种(Human enterovirus A,HEV-A)。病毒呈20面体立体对称的球形结构,无囊膜。CVA16基因组包含7410个核苷酸,为单股正链RNA。CVA16感染常呈轻症反应,偶发神经系统症状和心肌炎,但近些年研究结果显示CVA16也可导致重症病例,若CVA16和EV71共感染易导致病毒重组引发严重的神经系统症状和HFMD大暴发。本研究将实验室选育的疫苗候选株CVA16-P4-L731进行传代,通过一日龄Balb/C小鼠感染性实验获知疫苗候选株在选育传代过程中发生了毒力减弱的现象。其中CVA16-P4-L731-P6相比于CVA16-P4-L731-P1在核苷酸1434(C-T)、2744(A-G)、2747(A-G)、3161(G-A)、3182(A-G)、4968(C-T)和6064(C-T)处发生了碱基改变,这些碱基突变均导致了相应编码氨基酸的变化,这些氨基酸分别是VP2 161(T-M)、VP1 102(N-D)、VP1 103(T-A)、VP1 241(E-K)、VP1 248(T-A)、2C 297(S-F)和3D 42(E-A)。本研究通过反向遗传学技术以CVA16-P4-L731-P1为模板构建了全长c DNA,并在Vero细胞上进行了病毒拯救,对拯救后的病毒进行致细胞病变、病毒核酸和蛋白合成的检测,证实其具有感染性,为研究CVA16病毒的毒力位点提供了工具和手段。本研究还以CVA16-P4-L731-P6为模板构建了4株重组病毒克隆株,同时将CVA16-P4-L731-P6进行空斑纯化挑选出一株病毒克隆株,拯救的CVA16-P4-L731-P1株和CVA16-P4-L731-P6株经过腹腔注射一日龄Balb/C小鼠测定各病毒株的LD50,通过比较各个病毒株LD50的差异得知2C 297、VP1102和VP1 241可能与CVA16-P4-L731-P6在一日龄Balb/C小鼠模型上的减毒有关。同时成功通过感染性c DNA以2BS细胞为基质进行病毒拯救,获得没有Vero细胞传代背景的有感染性且滴度较高的病毒,数据显示感染性c DNA作为毒种库可以在较短代次内获得较高滴度的病毒,降低病毒突变的风险,初步探索感染性c DNA在改变疫苗生产用细胞基质方面的应用。
【关键词】：柯萨奇病毒A组16型 感染性c DNA 病毒拯救 重组病毒克隆 减毒位点 2BS基质
【学位授予单位】：武汉生物制品研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R725.1
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-20
• 第一章 实验材料和方法20-46
• 1.1 实验材料20
• 1.2 主要试剂（名称，公司，，货号）20-21
• 1.3 主要仪器与设备（公司，型号）21-22
• 1.4 主要试剂和培养基的配制22-24
• 1.5 通用实验方法24-29
• 1.6 实验方法29-46
• 第二章 CVA16-P4-L731-P1全长c DNA的构建46-55
• 2.1 CVA16-P4-L731-P1和-P6株在Balb/C小鼠模型上的毒力检测46-47
• 2.2 CVA16-P4-L731-P1和-P6序列分析47-50
• 2.3 CVA16-P4-L731-P1全长c DNA的构建50-54
• 2.4 小结54-55
• 第三章 在Vero细胞基质上的病毒拯救及验证55-61
• 3.1 体外转录55
• 3.2 病毒RNA转染Vero细胞55-56
• 3.3 拯救后病毒验证56-59
• 3.4 小结59-61
• 第四章 重组病毒克隆株的构建及减毒位点的确立61-68
• 4.1 CVA16-P4-L731-P6亚克隆的构建61-62
• 4.2 重组病毒克隆株的构建62-64
• 4.3 重组病毒株的获得64
• 4.4 CVA16-P4-L731-P6空斑纯化64-66
• 4.5 动物实验66-67
• 4.6 小结67-68
• 第五章 在 2BS细胞基质上的病毒拯救及验证68-72
• 5.1 病毒RNA转染 2BS细胞68
• 5.2 拯救后病毒验证68-71
• 5.3 小结71-72
• 第六章 总结和讨论72-79
• 6.1 总结72-73
• 6.2 讨论73-78
• 6.3 后期展望78-79
• 参考文献79-85
• 综述85-92
• 参考文献89-92
• 附录92-100
• 致谢100

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本文编号：714103